[发明专利]一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术

权利要求书

1.一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，其特征在于该技术包括以下步骤：

（1）样品收集：在小型离心管中收集微量微生物样品，包含液体的样品通过短时间高速离心，去除液体部分；

（2）样品裂解：加入直径0.1mm-0.5mm玻璃珠至管总体积的1/8，加入1/8管总体积的1mg/ml浓度的proteinase K悬液，40-70℃保温5-30分钟后，立即1000rpm以上速度进行水平或垂直震荡；

（3）核酸收集：加入5-10%浓度的1/4管总体积的chelex液，80-95℃保温10-30min，短时间高速冷冻离心，取上清液冷冻保存；

（4）带标记引物的PCR扩增：

①根据待扩增基因序列的保守区设计通用的上下游引物；

②在上下游引物5’端至引物的中部区域之间引入1-2个错配碱基作为特异标记，上游引物设计24种错配组合，下游引物设计16种错配组合，这样就形成了384个不同的引物组合，可以对应384个不同PCR管位置；

③在引物的5’端加上30-35个碱基的接头，衔接后续高通量测序时的PCR扩增，同时进一步加强扩增稳定性；

④各个样品利用带有不同标记位点的引物分别进行扩增；

（5）PCR产物混合测序和位置还原：将各管PCR产物混合后进行高通量测序，通过各管引物标记组合的不同将各序列还原到各位置样品管中。

2.根据权利要求1所述的高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，其特征在于：这里的微量生物样品泛指便于微量移液管操作的各种生物样品。

3.根据权利要求1所述的高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，其特征在于：提取容器可以是在多个单管操作、12联管、96孔板或384孔板装置中同时操作，实现高通量低成本。

4.根据权利要求1所述的高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，其特征在于步骤（5）的具体内容有：

①扩增后每管各取1-5μl产物进行混合，混合后作为一个样品进行高通量测序；

②测序得到的数十万条序列，利用计算机软件识别其标记位点，重新把序列分配到各样品管中。