[发明专利]一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术

说明书

本发明涉及一种分子生物领域，尤其涉及一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，包括高质量基因组提取和序列检测分析这两方面内容。本发明旨在降低微量生物样品分子鉴定的高通量测序成本。上述的一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，步骤如下：1）样品收集；2）样品裂解；3）核酸收集；4）带标记引物的PCR扩增；5）PCR产物混合测序和位置还原。本发明不需要制备复杂的原生质体，受体来源简单，适合没有孢子的真菌转化。另外，本发明简化和提升了现有的DNA提取技术，使研究者能够利用实验室的一些简单小型设备，方便地开展大规模的高质量基因组提取；同时整合普通PCR和高通量测序技术，结合计算机分析，对上述提取的DNA实现低成本的PCR序列扩增和测序分析。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，包括微量生物样品的高质量基因组提取和序列检测分析这两方面内容。

背景技术

现代分子生物技术在DNA样品提取，PCR扩增和测序等方面逐步进入高通量处理时代，这在不少研究领域是非常必要的，比如以分子手段研究某些生物特定基因位点的多样性时，通常必须面对大量的样品（包括动植物细胞和微生物），这种高通量处理通常需依赖昂贵的自动化处理机器和试剂盒。对于条件一般的实验室研究，如果按照常规方法用试剂盒人工逐个进行基因组提取、PCR扩增和测序，不仅费时费力，而且在费用上往往也难以承受。在DNA提取方面，利用试剂盒提取单个样品的高质量DNA并不难，而进行样品的批量快速低成本的提取则需要方法上的改进和优化。近年来，不少研究者提出了很多DNA提取方法的改进，但往往是仅针对一种微生物样品，如仅针对革兰氏阴性菌等，这使得在同时提取各种样品时就会面临困难，如肠道菌种既有革兰氏阴性菌这类比较容易提取DNA的样品，也有像双歧杆菌这样难以提取DNA的革兰氏阳性菌；而且，为满足大规模提取的需要，以往的大多数改进往往过于简化提取过程，严重降低了提取DNA的质量。在序列检测分析方面，PCR和经典测序法虽然已经非常成熟可靠，但是要进行成千上万的样品的测序时还是费时费力，使得高通量测序虽然测序量惊人，但每个样品的测序费用也不便宜，使用成本很高。

发明内容

为了解决上述技术问题，以便能经济快速地开展基于高通量的微量生物样品分子鉴定，本发明中提出了两个方面的创新内容：第一是简化和提升现有的DNA提取技术，使研究者能够利用实验室的一些简单小型设备，方便地经济快速地大规模提取高质量基因组；第二是整合普通PCR和高通量测序技术，结合计算机分析，对上述提取的DNA实现低成本的PCR序列扩增和测序分析；

本发明采用了以下的技术方案来实现上述的第一个创新内容：

作为优选，该技术方案包括以下的步骤：

（1）根据样品的干湿状态分别处理：微生物菌落等比较干燥的样品，直接挑取样品到离心管中就可进行下一步；如果是液体细胞悬液，则先4℃10000g离心1min，去上清液，加无菌水清洗一次，再4℃10000g离心1min，去上清液；管子可以选用排管和96孔板；

（2）根据管的体积，加入直径0.1mm-0.5mm玻璃珠至管总体积的1/8，再加入浓度为1mg/ml的1/8管总体积的proteinase K悬液，40-70℃保温5-30分钟后，以1000rpm以上速度水平或垂直震荡5min；

（3）加入10%浓度的1/4管总体积的chelex液，打散后，95℃10-20min，再冰浴；

（4）4℃10000g离心1min，取上清液做模板，冷冻保存；

本发明采用了以下的技术方案来实现上述的第二个创新内容：

作为优选，该技术方案包括以下的步骤：

（1）设计引物标记位点对应不同PCR管；

（2）PCR扩增和样品混合测序；

（3）根据测出引物序列还原不同引物所在的PCR管位置；