[发明专利]一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法

说明书

本发明公开了一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，涉及核酸检验技术领域。所述方法包括待测样本加入蛋白酶K，加入裂解液和提取磁珠混匀反应后磁性环吸附磁珠，加入清洗液，混匀，重悬磁珠，磁性吸附磁珠，移除液体，干燥后洗脱液重悬磁珠；加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，等温扩增获得扩增产物；加入亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM‑DNA‑NH2‑荧光探针磁珠，孵育后形成扩增子磁珠，磁性吸附磁珠，弃上清液，干燥得到混合磁珠；加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后磁性吸附磁珠，蓝光下观察。把核酸提取‑扩增‑检测一管完成，过程仅更换不同条件的反应液，结合在磁珠上的提取样本、引物、探针可实现不同反应体系的自由转换，完成精准定性检测。

技术领域

本发明涉及高强纤维材料技术领域，具体是一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法。

背景技术

生物样本的核酸检测用途广泛，包括疾病诊断，科学研究，病原体诊断，物种鉴定等等，目前成熟的技术主要是依靠核酸提取及PCR扩增基因靶向核酸获取，测序、电泳、荧光定量对核酸序列进行定性，此类方法在实验室专业技术人员操作及实现难度不大，但是对于非专业人员或缺少相关专业设备的机构或个人，核酸定性的检测相当困难，以往的技术是难以实现的。

除核酸检测外，抗体检测技术也是病原体检测的一大手段，目前有胶体金试剂可完成抗体检测，方法简便，不需要设备，但是此方法相对于核酸检测，有非常明显的劣势，例如病原体感染初期进行依靠蛋白或抗体的定性，由于丰度过低，很容易出现假阴性，还有其他抗体或者病原体的干扰，此类检测也容易出现假阴性。核酸检测是病原体检测的金标准有绝对的优越性，这点抗原或抗体检测是无法代替的。

因此，早日实现核酸的无场地限制检测显得非常重要，这样可以第一时间对病原体定性，减少运输造成的病原体传播风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，所述方法包括以下步骤：

反应管的待测样本加入蛋白酶K，加入裂解液和提取磁珠混匀后反应；反应后的反应管置于磁性环境下吸附磁珠，加入清洗液，取出反应管混匀，重悬磁珠，于磁性环境下吸附磁珠，移除液体；干燥后洗脱液重悬磁珠；

加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，等温扩增获得生物素修饰的靶向的扩增产物；

所述混合磁珠加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后于磁性环境下吸附磁珠，扩增子磁珠上携带的靶标DNA序列与Cas12a+crRNA复合物结合，激活Cas12a非特异性切割活性，激活的Cas12a可使固定于DNA-FAM荧光探针磁珠的DNA-FAM被切断，FAM释放游离到液相，蓝光下观察；

所述混合磁珠加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后于磁性环境下吸附磁珠，扩增子磁珠上携带的靶标DNA序列与Cas12a+crRNA复合物结合，激活Cas12a非特异性切割活性，激活的Cas12a可使固定于DNA-FAM荧光探针磁珠的DNA-FAM被切断，FAM释放游离到液相，蓝光下观察；

其中所述亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM-DNA-NH2-荧光探针磁珠重量比为1:1。

优选的，所述待测样本加入蛋白酶K具体为：

EP管中加入待测样本后加入蛋白酶K，使用溶解液补齐至预定体积。

优选的，加入裂解液和提取磁珠摇匀，室温静置5-10min。

优选的，所述加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，混匀后在37℃～40℃下静置20min。