[发明专利]一种用于检测Cas3蛋白活性的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种用于检测Cas3蛋白活性的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括固定于反应器皿上的亲和素和双链DNA；所述双链DNA中含有可被Cas3识别的不互补区域；所述双联DNA的两端分别被荧光基团和生物素标记；通过所述生物素与所述亲和素的结合作用，可将所述双链DNA的一端固定于所述反应器皿上。本发明中的试剂盒和检测方法可以快速、有效、高通量地检测Cas3蛋白的活性，进而可以应用于Cas3的抑制剂的大规模筛选中，该筛选方法的Z因子可达0.58，符合高通量筛选模型的要求(介于0.5‑1.0之间)。通过利用所筛选出的抑制剂，可以控制Cas3蛋白活性，对细菌的免疫系统产生影响。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于检测Cas3蛋白活性的试剂盒及其应用。

背景技术

CRISPR系统是大多数细菌和古生菌的适应性免疫系统，用来抵抗外来入侵的核酸。CRISPR位点是由细菌自身的重复序列(repeat)，及用于识别外源核酸的间隔序列(spacer)组成。CRISPR免疫系统执行功能，需要经历3个阶段：适应、表达及干扰。在适应阶段，细菌将来源于噬菌体或者外源质粒的核酸序列作为间隔序列，整合到CRISPR位点的重复序列之间。这些间隔序列执行序列记忆功能，以保证在之后的相应噬菌体或质粒的入侵过程中进行针对性的防御。在表达阶段，所有重复序列和间隔序列作为一个整体，被转录成crRNA前体，最终被相应Cas蛋白处理成成熟的crRNA。在干扰阶段，crRNA作为向导，与入侵的核酸互补配对，同时由相应的Cas蛋白进行识别以及切割外源入侵核酸。

根据cas基因组成、Cas蛋白与基因结构之间的序列相似性，目前将CRISPR系统分为两类(1类和2类)，其中1类中包含3种型别(I型、III型和IV型)，2类中也包含3种型别(II型、V型和VI型)以及19个亚型。在属于I-F型的绿脓杆菌CRISPR系统应用的干扰阶段，Cas3作为一个重要的蛋白参与其中。将前两个阶段获取的RNA作为向导RNA，与4个Csy蛋白形成Csy效应复合物。这一复合物可以识别并解旋再次入侵的同源核酸，并形成同源核酸R环结构。Csy复合物在识别同源核酸的同时，对Cas3核酸酶蛋白进行招募，Cas3能够识别被Csy效应复合物解旋的R环结构，并进行核酸降解。

有文献报道，Cas3可以不用借助Csy复合物的招募，通过构建带有一段不互补区域的双链DNA，Cas3可以识别这一不互补区域，并进行切割。

对于Cas3蛋白活性的研究，将有利于细菌CRISPR系统机理的研究，可通过控制Cas3蛋白活性，对细菌的免疫系统产生影响。因此，有必要提供一种用于检测Cas3蛋白的试剂盒及其应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种简便、灵敏、快速的用于检测Cas3蛋白活性的试剂盒及其应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用于检测Cas3蛋白活性的试剂盒，包括：

(1)固定于反应器皿上的亲和素；

(2)双链DNA；所述双链DNA中含有可被Cas3识别的不互补区域；所述双联DNA的两端分别被荧光基团和生物素标记；

通过所述生物素与所述亲和素的结合作用，可将所述双链DNA的一端固定于所述反应器皿上。

本发明中所提到的“固定于所述反应器皿上的亲和素”中，固定方法一般为包被，为了使亲和素固定在反应器皿上，同时不影响亲和素与生物素的结合作用，本领域人员也可以选用其他方法，在此不做进一步限定。

只要存在PAM位点，有不互补区域，就可以被Cas3所识别。

作为优选，在所述双链DNA中，不互补区域的长度为9～11nt，优选为10nt。