[发明专利]传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光PCR检测试剂盒

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光PCR检测试剂盒。本发明的试剂盒包括病毒特异性扩增引物和探针、阳性标准品、阴性标准品、Taq酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、反应缓冲液、dNTP、无核酸酶水和冻干保护剂。本发明试剂盒利用三重荧光PCR可以多个通道同时检测，使用不同荧光标记的探针，做到可以一个反应体系同时检测三种病毒，降低了检测难度，缩短了检测时间，可以帮助养户准确及时的拿到检测结果。本发明试剂盒检测灵敏度高、稳定性高，特异性强，与其他水产病毒没有交叉反应，可以用于疫病的早期监测和防控。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

传染性脾肾坏死病又称鳜爆发性传染病。1994年，广东鳜鱼养殖区爆发了高死亡率的传染性疾病；从患病鳜鱼中提取出了主要病原并将其命名为传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)，主要感染脾肾，表现为发病器官肿大，感染后鳜鱼在7～12d内死亡率达100％；除此之外还可感染50多种海、淡水养殖鱼类。ISKNV属虹彩病毒、细胞肿大病毒属；病原基因为双链DNA，约111362kb，含有124个潜在的开放阅读框(ORF)，其中主衣壳蛋白(MCP)基因高度保守。

大口黑鲈病毒(Largemouth bass ranavirus，LMBV)最早于1991年分离自美国的野生大口黑鲈，1996年被正式命名为大口黑鲈病毒，属虹彩病毒科，蛙病毒属。LMBV不仅仅感染大口黑鲈，对太阳鱼、鳜鱼也有一定的致病力；在两栖类、禽类，甚至鱼饵中均能存活，且存在多种传播途径，鱼鳔、鳃、和后肾是易受感染的器官。LMBV目前研究较多的是MCP蛋白基因。

鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)是造成鳜鱼病毒性病害的一种主要病原，最早于1999年在广东收集的病鳜中发现；寄主广泛，乌鳢、加州鲈、黄鳝等淡水鱼均能分离出该病原。SCRV属弹状病毒科，是一种单股负链RNA病毒。弹状病毒的基因组在11～15kb之间，都编码5个共同的结构蛋白，其中核衣壳蛋白基因较为保守。受弹状病毒感染的鱼类有共同的临床症状，如造血器官坏死，导致从体表到内部器官出血。

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大口黑鲈病毒(LMBV)、鳜弹状病毒(SCRV)是三种常见且易发的淡水养殖鱼传染性病原，每种疾病都能导致大规模爆发与流行，造成严重经济损失。

由于现在淡水鱼普遍采用规模化养殖的方式，且目前还没有针对三种病毒的疫苗或治疗方法，如果不能在苗种阶段发现病毒感染，或是在养殖过程中及早发现，并采取相应的防治措施，将会对养殖渔场造成巨大的经济损失；三种病毒在发病期都有比较相似的出血症状，从外观上很难判断是什么病毒感染；而在病毒感染早期，没有明显临床症状时，用传统的观察法或普通PCR法是很难提前鉴别出病原的。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明提供了一种三重荧光PCR法实时、准确、快速，同时检测传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的试剂盒。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种同时检测传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的的引物。

本发明的第二个目的在于提供一种同时检测传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的探针。

本发明的第三个目的在于提供一种同时检测传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的试剂盒。

本发明的第四个目的在于提供一种三重荧光PCR法快速检测传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的方法。

本发明所采用的技术方案如下文所述。

本发明的一方面涉及一种引物组，包括：