[发明专利]鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用

权利要求书

1.一种鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用，其中，鸡沙门菌SifA蛋白的氨基酸序列组成如SEQ ID No.2所示。

2.一种用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括鸡沙门菌SifA蛋白作为包被抗原的酶标板、由沙门菌感染SPF鸡所制备的阳性对照血清、健康SPF鸡阴性血清、兔抗鸡酶标二抗、血清稀释液、10倍浓缩洗涤液、显色液A、显色液B和终止液；所述鸡沙门菌SifA蛋白对应的sifA基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

3.根据权利要求2所述用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板的制作方法如下：

用pH9.6的0.5 M碳酸盐缓冲液将鸡沙门菌SifA蛋白稀释为0.25 μg/mL，每个酶标孔加入100 μL，4℃包被12 h，用PBS缓冲液制备成质量分数为5%的脱脂牛奶作为封闭液，37℃温箱孵育2 h。

4.根据权利要求2所述用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述鸡沙门菌SifA蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）根据鸡沙门菌sifA基因的核苷酸序列合成得到鸡沙门菌sifA基因，并设计带有酶切位点的引物：

P1：CCGGAATTCCCGATTACTATAGGGAATGG，

P2：CCGCTCGAGTTAGCCGCTTTGTTGTTCT；

2）将PCR产物与pET-28a载体酶切连接，构建得到重组质粒pET-28a-sifA，将重组质粒pET-28a-sifA转化入大肠杆菌感受态细胞BL21中，用LB液体培养基扩大培养，并加入IPTG诱导蛋白的表达；

3）将诱导后的大肠杆菌离心取沉淀，加缓冲液重悬，用低温超高压细胞破碎仪破碎重悬的菌体，再经离心取上清液，对上清液中的SifA蛋白进行纯化，得到重组蛋白SifA，即为鸡沙门菌SifA蛋白。

5.根据权利要求2所述用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照血清为SPF鸡感染沙门菌后20 d，翼下静脉采集血液所制备的血清；所述健康SPF鸡阴性血清为同等条件下健康SPF鸡的血清；

所述血清稀释液为：PBS缓冲液中含质量分数为0.2%的牛血清白蛋白和体积分数为0.05%的Tween-20；

所述10倍浓缩洗涤液：浓缩10倍的PBS中加入体积分数为0.5%的Tween-20，混匀，分装成30 mL/瓶；

所述显色液A：柠檬酸9.33 g，Na₂HPO₄·12H₂O 14.60 g，过氧化氢脲0.52 g，加700 mL去离子水溶解，并调节pH值至5.0~5.4，定容至1000 mL，分装成10 mL/瓶；

所述显色液B：四甲基联苯胺10 mg、无水乙醇5 mL，加去离子水溶解并定容至500 mL，分装成10 mL/瓶；

所述终止液：1.25 mL氢氟酸溶液加入到300 mL去离子水中，定容至500 mL，分装成10mL/瓶。

6.一种权利要求2所述鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）用血清稀释液将待检样品鸡血清做1:200倍稀释，每份样品取100 μL加入酶标板中，同时取阳性对照血清、健康SPF鸡阴性血清100 μL分别加入酶标板中，37℃温箱孵育30 min后，弃掉酶标板中稀释的血清，每孔加入200 μL洗涤液，静置5 min，弃掉洗涤液并拍干，重复洗涤3次；其中，所述待检样品鸡血清为临床鸡翼下静脉采集血液所制备的血清；

2）用PBS将兔抗鸡酶标二抗以1:10000稀释，每孔加入100 μL，37℃温箱孵育30 min后；弃掉酶标二抗，每孔加入200 μL洗涤液，静置5 min，弃掉洗涤液并拍干，重复洗涤3次；

3）每孔先加入50 μL显色液A，再加入50 μL显色液B，混匀，室温避光显色15 min后，每孔加入终止液50 μL，10 min内在酶标仪上测定630 nm波长处的吸光度值；

4）结果判定：根据统计学分析方法判定阴、阳性临界值：

S/P值≥0.268时，判定为阳性，阳性说明样品含沙门菌抗体；

S/P值0.268时，判定为阴性，阴性说明样品不含沙门菌抗体。