[发明专利]一种Cas6蛋白功能活性的检测方法及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种Cas6蛋白功能活性的检测方法及其应用。本发明的Cas6蛋白功能活性的检测方法中，所述Cas6蛋白来源于I‑F型CRISPR系统的绿脓杆菌，其包括：(1)在RNA的两端分别标记荧光基团和猝灭基团，获得底物；所述RNA由CRISPR位点中的一个重复序列在一端连接一个间隔序列组成，所述CRISPR位点来源于所述绿脓杆菌的I‑F型CRISPR系统；(2)将所述底物与所述Cas6蛋白反应后，检测荧光信号。本发明方法简便、灵敏、快速，可应用于筛选Cas6蛋白的抑制剂。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种Cas6蛋白功能活性的检测方法及其应用。

背景技术

CRISPR系统是大多数细菌和古生菌的适应性免疫系统，用来抵抗外来入侵的核酸。CRISPR位点是由细菌自身的重复序列(repeat)，及用于识别外源核酸的间隔序列(spacer)组成。CRISPR免疫系统执行功能，需要经历3个阶段：适应、表达及干扰。在适应阶段，细菌将来源于噬菌体或者外源质粒的核酸序列作为间隔序列，整合到CRISPR位点的重复序列之间。这些间隔序列执行序列记忆功能，以保证在之后的相应噬菌体或质粒的入侵过程中进行针对性的防御。在表达阶段，所有重复序列和间隔序列作为一个整体，被转录成crRNA前体，最终被相应Cas蛋白处理成成熟的crRNA。在干扰阶段，crRNA作为向导，与入侵的核酸互补配对，同时由相应的Cas蛋白进行识别以及切割外源入侵核酸。

根据cas基因组成、Cas蛋白与基因结构之间的序列相似性，目前将CRISPR系统分为两类(1类和2类)以及19个亚型，其中1类中包含3种型别(I型、III型和IV型)，2类中也包含3种型别(II型、V型和VI型)。在属于I-F型的绿脓杆菌的CRISPR系统的表达阶段，Cas6作为一个重要的蛋白参与其中。在适应阶段一些相关蛋白将入侵核酸作为间隔序列整合到CRISPR位点，转录后形成长链的crRNA前体。这一crRNA前体是由重复序列和间隔序列组成的，间隔序列插入到一个个重复序列之间(这些重复序列是一个个的茎环结构)，而Cas6蛋白能够识别并切割crRNA前体中的重复序列，在重复序列的3’端进行切割，形成一个个的带有记忆性片段的小RNA。当有外源核酸再次入侵时，这些小RNA就能够作为向导，靶向识别入侵核酸，随后通过相关蛋白予以降解。

对于Cas6蛋白活性的研究，将有利于细菌CRISPR系统机理的研究，可通过控制Cas6蛋白活性，对细菌的免疫系统产生影响。因此，有必要提供一种Cas6蛋白功能活性的检测方法及其应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种简便、灵敏、快速的Cas6蛋白功能活性检测方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种Cas6蛋白功能活性的检测方法，所述Cas6蛋白来源于I-F型CRISPR系统的绿脓杆菌，包括：

(1)在RNA的两端分别标记荧光基团和猝灭基团，获得底物；所述RNA由CRISPR位点中的一个重复序列在一端连接一个间隔序列组成，所述CRISPR位点来源于所述绿脓杆菌的I-F型CRISPR系统；

(2)将所述底物与所述Cas6蛋白反应后，检测荧光信号。

本发明中，Cas6蛋白序列为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者，如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有与所述Cas6蛋白相同功能的氨基酸序列。

底物中，CRISPR位点中的一个重复序列的一端连接有一个间隔序列，间隔序列中，碱基数目不限，为了节约成本简化操作，可仅采用一个碱基作为间隔序列。荧光基团和猝灭基团具体连接的端点位置不限，荧光基团和猝灭基团既可以连接于3’端也可以连接于5’端，只要保证两者分别连接于同一条RNA序列的两端即可。

本发明中，荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1。