[发明专利]一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基及发酵和制备色素粗品方法

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基及发酵和制备色素粗品方法。上述培养基，按1L体积计算，是由如下重量的原料组成：胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，氯化钠10g，3‑(N‑吗啉)丙磺酸5g，剩余为水；发酵过程采用变温培养方式控制，前期37℃以菌体生长为主，后期28℃以生产产物为主；色素粗品采用旋转蒸发和真空冷冻干燥的方法制备。本发明的培养基配方营养丰富，促进大肠杆菌生长代谢，且发酵过程采用变温培养的方式适合大肠杆菌前期生长和后期产素的需求，发酵周期较短。制备色素粗品的方法适合于实验室水平小量制备，并可应用于indigoidine标准曲线的制作。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌产indigoidine培养基及发酵和制备色素粗品方法

背景技术

植物和微生物是生产天然蓝色素的主要原料来源。植物天然蓝色素主要有靛蓝、栀子蓝。链霉菌、假单胞菌、基因工程菌株等微生物中的某些种类能够产生天然蓝色素，如放线菌紫(红)素、紫色杆菌素等，且微生物所产的某些色素还兼有抗菌效果。

indigoidine是一种无毒的微生物天然蓝色产物。indigoidine合成酶(indigoidine synthetase)是非核糖体多肽合成酶，最适酶活为28℃，经4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferases，PPTase，EC 2.7.8.7)活化，将微生物体内的2分子谷氨酰胺合成为1分子indigoidine。最早从植物病原菌欧文氏杆菌(Erwiniasp.)中发现indigoidine色素并分离，其具有清除自由基的能力使植物病原菌可耐受植物应激防御反应所分泌的过氧化物。之后陆续从其他微生物产物中也发现了indigoidine，如：假单胞菌(Pseudomonas sp.)、福格斯氏菌(Vogesella sp.)。近年来，在多种链霉菌，如淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)与色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)，的基因组中发现indigoidine合成酶基因并以沉默基因的形式存在，目前通过分子克隆技术，使其在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌等宿主中成功异源表达。

indigoidine为非水溶性蓝色素，能够溶解于少数几种有机溶剂，如DMF、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃、吡啶、N-甲基吡咯烷酮等。还可被连二亚硫酸钠还原为隐色体形式。该色素具有一定的抗菌性和氧化还原性。

当前indigoidine在很多方面已有应用的报道。在分子生物学中可作为筛选标记，如应用于蓝白斑筛选系统。色素明亮深邃的蓝色类似于靛蓝，也可作为新型天然蓝色素及染料应用于印染、食品和医药行业，目前已有报道其用于蛋白质类纤维织物的染色。由于indigoidine结构性质，使其具有作为有机半导体材料的潜能，在太阳能、信息记录和液晶材料等方面有广阔的开发应用前景。

目前通过基因工程和微生物发酵技术，使大肠杆菌成功发酵生产indigoidine色素。但当前使用的发酵温度偏低，不易控制，整个发酵周期大于30h，且LB培养基的增菌效果一般，色素产量偏低，发酵液后期pH偏高，不利于色素的生产。在制备色素粗品方面，由于indigoidine不溶于水的性质，采用超高速离心从发酵液中获取产物的方法，需要超高速离心设备，不适于一般实验室与工厂条件，且其它方法以DMSO作为提取色素溶剂时，受温度影响较大，价格偏高。

发明内容