[发明专利]基于LAMP快速检测抗咪鲜胺的S312T基因型藤仓镰孢菌的方法

权利要求书

1.用于检测抗甾醇合成抑制剂类杀菌剂S312T基因型恶苗病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：环介导等温扩增引物组合物由以下4条引物组成：

F3：5’ - TGATCATGAGGTCGCCCATA -3’

B3：5’ - TTGGCAAGGTCGTCGTAAG -3’

FIP：5’ - GACGGAGCATGATCCAAGAGCTTCATGGCTGGCCAGCACG -3’

BIP：5’ - ACCCTCACATCATGGAGGAGCTTCAAGGGAGGCAAATCAGC -3’。

2.根据权利要求1所述的用于检测抗甾醇合成抑制剂类杀菌剂S312T基因型恶苗病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：

由含恶苗病菌Cyp51B基因312位点突变区域，错配碱基设计的引物组构成，环介导等温扩增反应用于检测抗甾醇合成抑制剂类杀菌剂S312T基因型的恶苗病菌。

3.用于检测抗甾醇合成抑制剂类杀菌剂S312T基因型的恶苗病菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的环介导等温扩增引物组合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：引物组合的终浓度为：0.8 μM的正内向引物FIP，0.8 μM的反向内引物BIP、0.3 μM正向外引物F3、0.3 μM反向外引物B3。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含环介导等温扩增反应预混液：10X ThermoPol Reaction Buffer 、1 mM dNTPs、4 mM MgCl₂、0.6 M 甜菜碱、150μM 羟基萘酚蓝、8 U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

6.用于检测抗甾醇合成抑制剂类杀菌剂S312T基因型的恶苗病菌的环介导等温扩增方法的反应体系，其特征在于：利用如权利要求1所述引物F3、B3、FIP和BIP；

25 μL反应体系由以下成分组成：8 U/μLBst DNA聚合酶0.5 μL、10×ThermoPolBuffer 2.5 μL、10 μM FIP 2.0μL、10 μM BIP 2.0 μL、10 μM F3 0.75 μL、10 μM B3 0.75μL、25 mM MgCl₂4.0μL、10 mM dNTPs 2.5 μL、5 M甜菜碱3.0 μL、3.75 mM羟基萘酚蓝1 μL、DNA模板1 μL，双蒸水补足至25 μL。

7.利用如权利要求6所述的反应体系进行的环介导等温扩增方法，其特征在于：

利用所述反应体系进行环介导等温扩增反应，选择以下任一方法：

方法一、在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，显色结果观察到蓝紫色判断为阴性；

方法二、取5 μL扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，无扩增条带则判断为阴性。

8.根据权利要求7所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：

阳性，表示检测到甾醇合成抑制剂类抗药型S312T突变型恶苗病菌；

阴性，表示检测菌株为敏感型恶苗病菌，或所含水稻恶苗病病菌含量未达检测的最低检测浓度0.01 ng/μL。

9.根据权利要求7或8所述的环介导等温扩增方法，其特征在于环介导等温扩增扩增反应程序为：64℃扩增60 min，80℃灭火10 min。