[发明专利]基于LAMP快速检测抗咪鲜胺的S312T基因型藤仓镰孢菌的方法

说明书

本发明公开了一种用于检测抗甾醇合成抑制剂类杀菌剂S312T基因型恶苗病菌的环介导等温扩增引物，LAMP引物组合物由F3、B3、FIP、BIP这4条引物组成。本发明通过对藤仓镰孢菌Cyp51b基因中包含312位点突变的200～300bp序列进行LAMP引物错配设计，筛选出特异性强、灵敏度高、适用于LAMP快速分子检测的引物，进而建立可供该菌快速分子检测的技术。采用本发明的方法对S312T突变型病菌进行LAMP检测，反应过程简便(64℃恒温)、检测周期短(仅需60min)、特异性强、灵敏度高，可用肉眼观察检测结果。

技术领域

本发明属于植物真菌分子生物学检测技术领域，涉及用环介导等温扩增(LAMP)技术检测抗甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂咪鲜胺的S312T基因型藤仓镰孢菌的引物组其使用方法，，属于植物病害检测、鉴定、防治及抗药性病原菌早期预警的技术领域。

背景技术

藤仓镰孢菌(Fusraium fujikuroi)可引起水稻恶苗病，也能感染玉米等其它植物。其中恶苗病是一种传性真菌病害，在各个水稻主产区均有发生，苗期到抽穗期都可发生，发病轻的田块减产5-50％。该病害主要是由侵染引起，携带有病原菌的种子是水稻恶苗病的主要侵染源，如若将带菌的种子和将健康的种子一起浸种，无病种子会被污染。当种子长出新芽，病菌就能通过芽銷侵入幼苗，随着带菌幼苗的生长，菌丝逐渐蔓延至全株，并出现一系列的症状，如节间伸长，节部曝露与叶鞘外，分蘖能力削弱，叶色发黄，根系发育异常。发病程度轻的植株提早抽穗，穗形小而不实。在抽穗期，也可能发生病害，严重时谷穗变褐，无法结实，减少了水稻的产量。

咪鲜胺属于甾醇脱甲基抑制剂(DMIs)，对多种作物由子囊菌和半知菌引起的病害具有明显的防效。20世纪末引入中国，主要有25％施保克乳油和45％施保克水乳剂两种制剂，替代抗性发生严重的多菌灵应用于水稻恶苗病的防治。截止到2019年10月，中国农药信息网上数据显示已登记的152个用作防治水稻恶苗病的杀菌剂中85个有效成分含有咪鲜胺(http://www.icama.org.cn/hysj/index.jhtml)。到目前为止，咪鲜胺仍然是水稻恶苗病防治的主要药剂。麦角甾醇是真菌细胞膜重要的组成成分，其合成受到抑制将引起细胞膜结构与功能的破坏，最终导致细胞死亡。同时，甾醇作为一些甾类激素的前体，在真菌的生殖过程中起着重要的作用，其含量和组成成分的改变将影响真菌的生殖。甾醇生物合成抑制剂(sterol biosynthesis inhibitors，SBIs)能够抑制真菌麦角甾醇的生物合成，SBIs中的甾醇14α-脱甲基化酶抑制剂类(14α-dememylation inhibitors，DMIs)是目前SBIs中使用最广泛的一类杀菌剂。1970年DMI类化合物开始应用于农业病害防治，田间DMIs杀菌剂的抗药性不断被报道。镰孢菌及其它病菌对甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂的抗药性机制先后被报道有Cyp51基因的点突变、Cyp51基因的过量表达及转运蛋白在抗药性中的作用等多种不同的形式。植物病原菌的抗药性检测能为植物病害抗药性流行预警、抗药性治理提供重要的参考依据。传统的杀菌剂抗性检测或监测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为抗药性菌株，该方法检测周期较长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中常存在杂菌污染，给试验结果带来误差；同时，还需投入大量的人力资源，增加检测成本。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)也是体外快速扩增特定基因或DNA序列来检测抗药性突变体的最常用方法，灵敏度高，特异性强，但检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的实验过程，且检测时间长，检测成本高昂，不能满足经济、高效、快速检测的需求。