[发明专利]一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用

权利要求书

1.一种均匀液相体系下进行外泌体及其表面蛋白CD63及PD-L1分析的DNA纳米分子机器，其特征在于：包括外泌体表面蛋白CD63及PD-L1的识别探针、信号探针和燃料探针，外泌体表面蛋白CD63信号探针和外泌体表面蛋白PD-L1信号探针上修饰的荧光报告基团不同，

其中：识别探针是由引发链a与核酸适配体序列部分杂交形成的双链DNA结构，所述核酸适配体是指可与外泌体表面蛋白标志物特异识别结合的单链DNA；

信号探针是由三条DNA单链通过杂交反应自组装而成的双链DNA结构，三条DNA单链分别是：中间修饰有荧光报告基团的信号链d、末端修饰有荧光淬灭基团的淬灭链b和保护链c，淬灭链b和保护链c分别与信号链d上相邻两个区域互补杂交，且淬灭链b和保护链c间无碱基间隔，淬灭链b末端修饰的淬灭基团和信号链d中间修饰的报告基团对应位于双链间互补的碱基对上，信号链d上靠近淬灭链b的一端有一段未杂交序列，形成一个粘性末端，作为第一Toehold区域，介导由引发链a侵入引起的链置换反应；在信号探针中部荧光基团修饰位点区域隐藏有第二Toehold区域，介导由燃料链驱动的循环链置换反应的发生；

燃料探针是一条与信号链d序列互补的DNA单链，即燃料链e，其与信号链d互补杂交区域涵盖信号链d上的荧光报告基团修饰位点，序列长度长于淬灭链b和保护链c；

所述的外泌体表面蛋白CD63的各探针序列如下表1所示：

表1 CD63识别探针、信号探针和燃料探针的序列

；

所述的外泌体表面蛋白PD-L1的各探针序列如下表2所示：

表2 PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列

。

2.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：荧光报告基团为FAM、Cy3、Cy5，对应的荧光淬灭基团分别为BHQ1、BHQ2、BHQ2。

3.权利要求1所述的DNA纳米分子机器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）识别探针的制备：将核酸适配体和引发链a加入到一定体积连接反应缓冲液中，加热变性使DNA链打开局部二级结构，迅速降温至室温，使得两条寡核苷酸链杂交为识别探针，4℃下保存备用；

（2）信号探针的制备：将淬灭链b、信号链d和保护链c加入到链置换反应缓冲液中，混匀，使三条寡核苷酸链发生等温杂交形成一端为粘性末端的信号探针，4℃下保存备用。

4.包括DNA纳米分子机器的荧光生物传感系统，其特征在于：包括荧光分析系统和权利要求1所述的DNA纳米分子机器。

5.一种利用权利要求1所述的DNA纳米分子机器进行外泌体及其表面蛋白CD63及PD-L1双色分析的方法，其特征在于：包括以下步骤：将待测外泌体样品配成溶液，然后与识别探针溶液加入反应缓冲液体系中混合均匀，孵育反应；

将上述反应液和燃料探针溶液一起加入到含有信号探针的反应缓冲液中，室温反应，观察荧光发光情况，记录荧光强度变化，根据荧光发光情况及荧光强度变化进行外泌体分析，其中，所述的分析为：基于荧光强度变化值-外泌体浓度标准曲线，根据荧光强度变化值，进行外泌体浓度的定量分析，所述的荧光强度变化值△F为外泌体表面蛋白引起的荧光信号强度与背景信号之间的差值。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：荧光测定条件荧光光谱收集范围设置为500 nm-700 nm；

荧光报告基团为Cy3时，荧光检测条件：激发波长为550nm，发射波长为567 nm；

荧光报告基团为FAM时，荧光检测条件：激发波长为490 nm，发射波长为522nm；

荧光报告基团为Cy5时，荧光检测条件：激发波长为650nm，发射波长为670nm。