[发明专利]一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用

说明书

本发明涉及一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用。包含可对外泌体表面标志物产生响应的识别探针、包含两个Toehold区域的信号探针以及可驱动链置换反应循环进行的燃料探针。外泌体通过其表面标志物与识别探针中的特异适配体发生多价结合，释放识别探针中的引发链；引发链侵入信号探针，通过结合Toehold区域Ⅰ，驱动链的分支迁移释放出淬灭链，解放荧光报告基团，并暴露出隐藏的Toehold区域Ⅱ；燃料探针通过结合Toehold区域Ⅱ，启动Toehold介导的链置换循环反应，发生连续的分支迁移和多价回收。可实现外泌体的超灵敏定量检测；可实现外泌体表面两种或多种蛋白标志物的双色或多色分析；操作简单，耗时短，样品消耗量少，灵敏度高、特异性好。

技术领域

本发明属于快速检测技术领域，具体涉及一种外泌体或外泌体表面蛋白驱动的DNA纳米分子机器，其可用于外泌体及表面蛋白的定性和定量分析。它具有多价循环扩增的信号响应机制，能用于对肿瘤外泌体和外泌体表型分子的超灵敏检测。

背景技术

近些年来，精准医学的液体活检技术被广泛用于肿瘤的早期筛查，辅助诊断，疗效监测和药效预测。与传统的组织活检相比，液体活检具有无创性，能实时动态检测、克服肿瘤异质性、提供全面检测信息等独特优势。

目前的临床研究中，液体活检技术主要包括游离循环肿瘤细胞(CTCs)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测、外泌体检测等。外泌体是一种直径范围为30-150nm的双层磷脂膜封装的微囊泡，可来源于各种类型的细胞，包括淋巴细胞，神经细胞，上皮细胞和各种肿瘤细胞等。细胞内多囊泡体与胞膜通过内吞、融合、外排等过程向胞外分泌外泌体，释放到各种体液中。外泌体膜表面及囊泡内存在有多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质和DNA片段，还包括一些小分子RNA，如miRNA、lncRNA和mRMA等。藉由外泌体的转运，一些生物信息分子可以激活细胞表面受体，外泌体内容物可进入靶细胞内，对靶细胞起调节作用。因此，外泌体可参与免疫应答、抗原提呈和细胞间通讯等多种生理过程。肿瘤细胞来源的外泌体通过介导肿瘤细胞与周围及远端的组织或基质细胞之间的信息传递，可以实现对肿瘤细胞的增殖、转移以及肿瘤耐药等生物学行为的调控。由于外泌体的分子特征可以精确地反映其生物来源，从这些体液中分离提取外泌体，对其携带的肿瘤特异性表型蛋白和核酸分子进行鉴定和定量，有助于肿瘤的早期诊断，治疗监测和预后判断。

迄今为止，研究人员根据外泌体的生物学特征开发出多种外泌体的检测方法，常用的传统方法包括酶联免疫吸附技术(ELISA)和蛋白免疫印迹技术(Western blot)等，但是这些方法步骤繁琐，对操作者有较高的技能要求。近些年来，以流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)为代表的生物颗粒计数技术以及表面等离子体共振(SPR)、表面增强拉曼光谱技术(SERS)、场效应晶体管(FET)和电化学分析等生物传感平台也被广泛应用于外泌体的检测，并具有较好的检测性能。然而这些方法都依赖于昂贵的仪器设备，生物传感器件的制备还需要复杂的纳米制备工艺或者繁琐的界面工程，并且大多数生物传感技术需要昂贵的抗体来作为外泌体的识别元件，难以在临床实验室广泛开展。因此，我们急需开发出一种简单易行、价格低廉，适用于临床实验室的外泌体检测方法。荧光分析是临床上一种常规的检测平台，具有仪器成本低、操作简便等优点，近年来，已有报道采用荧光分析策略的外泌体的检测方案，并且取得了不同程度的成功。如刘映昕等采用上转换纳米材料(UCNPs)与金纳米棒(Au NRs)之间的荧光共振能量转移效应来检测外泌体。王慧等利用氧化石墨烯对单链荧光适配体的吸附和荧光淬灭效应来检测外泌体。这些方法虽然有效，但灵敏度相对较低，且不能实现同时对外泌体进行定量和表型分析。

因此，一种能够进行外泌体及其表面蛋白的定量和表型分析，灵敏度高的且成本低廉的快速检测系统亟待开发。

发明内容：