[发明专利]一种提高多重PCR扩增文库质量的方法

说明书

本发明提供了一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，属于PCR扩增技术领域。该方法是根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列来设计、合成两端含有与扩增子对应引物结合位点的多重PCR扩增差异靶标，该差异靶标和理论的扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异，构建人工合成差异核苷酸序列集合IAC。将IAC加入PCR反应体系中进行多重PCR扩增反应，引物可以结合到IAC集合上，大大减少多重PCR扩增中非靶标引物形成引物二聚体和产生非特异性扩增的可能，从而提高多重PCR扩增文库的质量，为后续检测出待检靶标提供较好的基础。

技术领域

本发明属于PCR扩增技术领域，具体涉及一种提高多重PCR扩增文库质量的方法。

背景技术

多重PCR是指在一个反应管中加入多对引物，同时进行PCR反应；加入引物的数量少则十几对，多则成百上千对引物。为此，如何避免多对引物间形成二聚体或非特异扩增成了一个提高扩增文库质量的一个关键技术点。

除了在引物设计、评估上减少引物3'端碱基的互补配对，引物两两间比对位置避开比对到多个基因组位置，仍然需要其它方法来避免多重PCR引物间形成二聚体或者非特异扩增，提高文库质量。

在某些特定环境，比如在待检测环境只存在多重PCR引物中的部分靶标的情况。例如，在一个多重PCR引物mix中包含了上百种微生物特异扩增的引物，但是某个检测样本中，实际只含有这上百种微生物中的某一两种。在这种环境下，上百种引物只有某几对引物实际会发生扩增，其它大量的引物会因为没有扩增靶标消耗，而形成大量的二聚体或者非特异扩增，导致扩增文库质量较差。即便后续通过常规的磁珠纯化也不能达到好的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，来减少多重PCR扩增产物的二聚体产生和非特异扩增，从而提高重PCR扩增文库质量。

本发明提供了一种提高多重PCR扩增文库质量的方法，包括以下步骤：

1)根据多重PCR中每个扩增子的扩增靶标序列，人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，但所述差异靶标序列与所述扩增靶标序列具有编辑距离大于5bp的差异序列；人工合成的差异靶标序列在测序读长范围内至少被检测到5bp以上的差异序列；

2)将步骤1)中若干条人工合成的差异靶标序列中，不少于总数量的10％进行混合，构建得到多重PCR人工合成带差异的序列集合；

3)以待测样本为反应模版，将所述多重PCR人工合成带差异的序列集合加入反应体系中进行多重PCR扩增反应，得到高质量的多重PCR扩增文库。

优选的，步骤1)中多重PCR中扩增子是候选检测生物分别经多重PCR引物扩增得到的扩增产物。

优选的，步骤1)中多重PCR中扩增子的数量根据候选检测生物的数量而决定。

优选的，步骤1)中所述差异序列中，以4种碱基数比例之和为100％计，4种碱基数量的比例均不大于70％。

优选的，步骤1)中所述差异序列由插入、缺失或错配形式。

优选的，步骤1)中所述差异序列包括插入一段20bp如序列表SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

优选的，步骤1)中所述测序读长为35～600bp。

优选的，步骤2)中在多重PCR人工合成带差异的序列集合中，各带差异序列的靶标序列的拷贝数不大于10⁸拷贝/mL。

优选的，步骤2)中所述多重PCR人工合成差异的序列集合包括序列表中SEQ IDNo.2～SEQ ID No.16所示的15条序列和/或SEQ ID No.111～SEQ ID No.126所示的16条序列。