[发明专利]新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了新型冠状病毒2019‑nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法。它包括如SEQ ID NO.1‑2所示的新型冠状病毒2019‑nCoV特异性引物和如SEQ ID NO.3所示的探针。本发明采用单管双荧光通道同时检测新型冠状病毒2019‑nCoV ORF1ab基因和内参基因RNase P的存在，能检测肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、痰液等样本中新型冠状病毒2019‑nCoV RNA的存在。本发明检测时间短，适用于临床和床旁病毒核酸快速筛查；具有极高的灵敏度和特异性；检测体系中加入内参基因，通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增过程进行质量监控。

技术领域

本发明属于生物技术和分子诊断领域，尤其涉及一种新型冠状病毒2019-nCoV荧光 RPA检测引物和探针、试剂盒和方法

背景技术

世界卫生组织将自2019年12月的病毒性肺炎病例的病原体命名为2019新型冠状病毒 即“2019-nCoV”。新型冠状病毒2019-nCoV属于冠状病毒科、beta冠状病毒属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠 状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV- HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引 起类似普通感冒的轻微呼吸道症状；另外2种是SARS冠状病毒和MERS冠状病毒(中东 呼吸综合症冠状病毒)。

目前核酸检测的主要方法为PCR法，常规的PCR检测需要特殊的热循环仪以及繁琐的实验程序，难以满足现场或实验室之外其他条件下的检测需要。近年来，一些核酸等温扩增技术逐渐发展起来，这些技术不需要昂贵的热循环PCR仪，并且可以在短时间内快速大量扩增出目的片段，具有简单、快速、灵敏度高等优点。其中的RPA技术更是被称为可以 替代传统PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡聚核苷 酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物 在常温下也具有活性，其最佳反应温度在37～42℃左右。RPA技术是模拟了生物体内DNA 复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来。它可以在极短的时间内使目的基因以指 数级增长，若配合荧光标记的探针和荧光信号检测仪便可实现对模板扩增的实时监测。RPA 技术大大减少了检测时间，简化了反应程序，结合快速核酸提取技术和便携式的实时荧光检 测设备后非常适用于床旁及机场、海关进出口等场所现场检测，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对新型冠状病毒2019-nCoV全基因组序列信息，提供一种新型冠状 病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法，从而满足快速、灵敏和准确检 测的需求。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针，它包括如SEQ ID NO.1-2所 示的新型冠状病毒2019-nCoV特异性引物和如SEQ ID NO.3所示的探针。

上述的荧光RPA检测引物和探针在制备新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测试剂盒 中的应用。

一种新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测试剂盒，该试剂盒包括上的荧光RPA检测 引物和探针。

作为一种优选技术方案，该试剂盒还包括如SEQ ID NO.4-5所示的内参基因RNaseP特 异性引物和如SEQ ID NO.6所示的内参基因RNase P特异性探针。

进一步优选的，该试剂盒还包括：

阳性对照：含新型冠状病毒2019-nCoV ORF1ab基因序列质粒；

阴性对照：RNase Free H₂O。