[发明专利]一种高通量的病原体微生物基因检测筛查方法在审
申请号: | 202010359019.0 | 申请日: | 2020-04-29 |
公开(公告)号: | CN111549109A | 公开(公告)日: | 2020-08-18 |
发明(设计)人: | 杨功达;曾丰波;胡秀弟 | 申请(专利权)人: | 苏州苏因智启生物科技有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6874 | 分类号: | C12Q1/6874;C12Q1/70;G16B20/30;G16B25/20;C12R1/93 |
代理公司: | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人: | 陆惠中;田欢 |
地址: | 215011 江苏*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 通量 病原体 微生物 基因 检测 方法 | ||
本发明属于生物领域,尤其设计一种高通量的病原体微生物基因检测筛查方法。一种高通量的病原体微生物基因检测筛查方法,包括:S1:设计探针;S2:芯片合成;S3:提取样品中的DNA或RNA;S4:文库构建;S5:文库目标区域杂交捕获和测序;S6:采用高通量测序平台检测;S7:进行生信分析,采用Samtools来计算病原体基因组序列每个位点的深度;与探针目标区域重叠的序列被视为“目标序列”;相反,则被视为“非目标序列”。本发明通过一次检测,可同时实现“靶向病原体检测”和“宏基因组检测”,既能提高靶向病原体的检测灵敏度,又能检测到未设计探针的病原体,扩大了检测范围。
技术领域
本发明属于生物领域,尤其设计一种高通量的病原体微生物基因检测筛查方法。
背景技术
病原体微生物的检测和鉴定对临床上判断感染类型及进行有针对性的治疗都具有非常重要的意义。病原体微生物种类繁多,来源广泛,而即使是不同种类的病原体感染,表现在临床症状上具有一定的相似性,比如普遍伴有发烧等症状,所以很难从临床表现区分感染类型,而准确有效的筛查或诊断检测方法具显得至关重要。目前临床上采用的病原体微生物检测方法主要有培养法,基于蛋白的抗原抗体特异性检测,以及基于核酸的基因检测,常见的有QPCR,一代测序和高通量测序等等。由于培养条件的局限性,可被培养的微生物种类较少,而且培养需要较长的时间周期,培养法的劣势比较明显。基于抗原抗体特异性检测具有速度快的优势,但能够检测的微生物种类不多,而且无法准确地确定具体的病原体微生物的物种。核酸检测具有较强的普遍性,在病原体微生物的检测上有着越来越广的应用。
病原体微生物的基因检测方法中,QPCR是应用最多的一种技术,通过选取微生物基因组中物种特异的序列,设计相应的引物或探针,通过相对定量的方法来确定样品中是否存在该病原体的感染,并计算病原体的基因组组拷贝数。QPCR对检测已知的病原体,有较大优势,成本低,速度快,准确率高。但临床上,多种病原体可能会有类似的感染症状,而QPCR的检测位点有限,需要多次检测才能满足对多种病原体实现检测的需求。同时,还有一些罕见或未知的病原体,又会引发临床症状,这些感染类型QPCR很难解决。
由于高通量测序成本的下降,以及目标区域捕获技术的发展,基于高通量测序的病原体感染检测也被越来越多地用到。目前常见的检测方式主要分为全基因组或宏基因组(WGS)和目标区域捕获测序两类。宏基因组测序不作任何假设前提,对待测样品中的所有物种的基因组都进行检测,虽然检测的范围很广,但是要求的数据量很大,并且其中大部分的数据都是来自背景的序列,数据有效率很低,检测的灵敏度有限,成本又非常高。
目标区域捕获测序,事先将一系列病原体的物种特异序列设计成探针或引物,对待测样品中的DNA进行目标区域富集,再进行测序分析。目标区域捕获测序常用的方法主要有液相杂交捕获,和多重PCR两类。目标区域捕获测序对目标区域进行了富集,检测的灵敏度相比全基因组测序大大提高,同时需要的测序数据量也较小,成本较低。但它只针对事先确定的病原体微生物进行检测,检测范围存在一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是通过液相杂交技术和高通量测序技术,同时实现对已知和未知病原体的筛查。既可以对目标的病原体进行捕获和富集,提高检测的灵敏度,又可以通过对“非目标区域”的序列进行分析,扩大检测范围。
具体的,本发明的技术方案如下:
本发明第一个方面公开了一种高通量的病原体微生物基因检测筛查方法,包括:
S1:设计探针;
S2:芯片合成;
S3:提取样品中的DNA或RNA;
S4:文库构建;
S5:文库目标区域杂交捕获和测序;
S6:采用高通量测序平台检测;
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