[发明专利]一种基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒

权利要求书

1.一种基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括微载体、引物对和探针；所述微载体具有与冠状病毒一一对应的编码信息，所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述探针序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其中，所述探针的核酸在5’端连接有荧光报告基团，在核酸的3’端连接有荧光淬灭基团，且两个探针的荧光报告基团不同。

3.根据权利要求1所述的基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其中，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3和CY5中的任一种。

4.根据权利要求1所述的基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其中，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ中的任一种。

5.根据权利要求1所述的基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含PCR缓冲液以及Taq酶。

6.根据权利要求1所述的基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

7.根据权利要求6所述的基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其中，所述阳性对照液为含有新型冠状病毒的扩增序列。

8.根据权利要求6所述的基于荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其中，所述阴性对照为RNase Free H₂O。

9.一种新型冠状病毒的RT-PCR检测方法，该方法包括以下步骤：

一、RT-PCR引物和探针设计

根据已获得的新型冠状病毒外膜蛋白基因序列，使用软件Primer Premier 5设计2条用于建立检测方法的引物和1条探针，所述引物和探针序列如SEQ ID NO：1～3所示：

二、采集样品，将含有检测目的片段重组质粒的构建和作为阳性对照的小RNA片段的制备，在体外构建用于体外转录的重组质粒，然后体外转录获得小RNA片段；

三、引物的特异性实验和灵敏度检测实验

1)特异性检测

使用冠状病毒的RNA为模板进行RT-PCR实验；RT-PCR和PCR反应条件和程序如下：

混合均匀后42℃反应1h，70℃反应15min终止反应后迅速置于冰上，然后将获得的逆转录产物作为模板进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下：

PCR程序为：60℃15min；95℃10s，92℃30s，60℃60s，45个循环；72℃5min；

2)灵敏度检测实验

检测该方法的敏感性，分别取不同浓度梯度的作为阳性对照的RNA 2μl为模板进行RT-PCR，逆转录和PCR条件和程序同特异性实验，然后使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。