[发明专利]用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法

权利要求书

1.用于检测NMO-IgG的稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括：

(1)构建过表达载体：

利用包含两个酶切位点的引物对，PCR扩增AQP4 M1基因，得到AQP4 M1 PCR产物；

利用与两个酶切位点相对应的限制性内切酶，分别酶切AQP4 M1 PCR产物和慢病毒载体；

连接AQP4 M1 PCR产物的酶切产物和慢病毒载体的酶切产物，得到过表达载体；

利用连接得到的过表达载体，转化感受态细胞；

利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素筛选转化后的感受态细胞，对筛选出的单菌落作扩增培养并从中提取过表达载体，电泳初筛提取的过表达载体并在初筛通过后送测序鉴定；

(2)包装慢病毒：

利用通过测序鉴定的过表达载体和慢病毒包装载体转染细胞，细胞内包装慢病毒，浓缩纯化慢病毒，并以带荧光标记的空载体作对照；

(3)慢病毒转导细胞：

利用慢病毒转导细胞，并通过观察空载体对照组的细胞荧光发光情况，来评估转导后细胞的病毒滴度；

(4)筛选稳转细胞株：

评估通过后，利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素持续作用转导后的细胞，以筛选出稳转细胞株并保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，该引物包括XhoI的酶切位点；

引物对的下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示，该引物包括XbaI的酶切位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

PCR扩增的反应体系中，引物浓度为50-300nM，DNA聚合酶用量为0.5-2.0U，PCR反应缓冲液为10*，dNTP浓度为100-400μM，Mg²⁺浓度为300-800μM，模板DNA用量为10-100ng；

扩增反应体系体积为20-50μl。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

PCR扩增的反应程序包括：94-98℃预变性2-10min；94-98℃变性10-90s，58-63℃退火10-90s，68-72℃延伸30-300s，共25-40个循环；68-72℃终延伸5-20min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

酶切反应的反应体系中，XhoI用量为5-20U，XbaI用量为8-20U，酶切反应缓冲液为10*，AQP4 M1 PCR产物用量为0.5-3μg，慢病毒载体用量为0.5-3μg；

酶切反应体系体积为20-50μl；

酶切反应的反应程序包括在37℃下持续1-5h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

连接反应的反应体系中，DNA连接酶的用量为200-700U，连接反应缓冲液为10*，AQP4M1 PCR产物的酶切产物用量为100-500ng，慢病毒载体的酶切产物用量为10-100ng；

连接反应体系体积为20-50μl；

连接反应的反应程序包括在4-16℃过夜。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，转化反应的反应体系中，过表达载体、感受态细胞和LB培养基的体积比为1：20：100-1：50：800。

8.利用权利要求1至7中任一所述构建方法所构建得到的稳转细胞株。

9.权利要求8所述的稳转细胞株在检测人血清中NMO-IgG中的应用。

10.权利要求8所述的稳转细胞株在筛选或制备抗NMOSD药物中的应用。