[发明专利]用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法

说明书

本发明提供了用于检测NMO‑IgG的稳转细胞株及其构建方法，该构建方法包括：构建包含AQP4 M1基因的过表达载体，过表达载体转染细胞包装慢病毒，慢病毒浓缩纯化后转导细胞，利用载体所含抗性对应的抗生素作用转导后的细胞，筛选得到稳转细胞株。本发明通过将外源基因整合到细胞染色体上，使得构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定的表达AQP4 M1蛋白，不具备瞬时感染所具有的外源基因表达持续时间短的缺陷。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法。

背景技术

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是视神经与脊髓同时相继受累的急性或亚急性脱髓鞘病变，是主要累及视神经和脊髓的自身免疫性疾病，大脑不受累，或即使大脑受累，其损害也未能达到多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的诊断标准。多发性硬化，是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的、获得性慢性复发或进展的自身免疫性疾病，病理特征性改变为中枢神经系统脱髓鞘白质斑块形成，病变多位于侧脑室周围，病变常累及白质的病干，脊髓和视神经也会受累。目前对NMO和MS的鉴别诊断，可依据现在专家共识的NMO、MS的诊断标准，但从临床实际应用来看，两者的鉴别诊断仍比较困难。

NMO-IgG(或称AQP4-IgG)的发现距今已有十多年的历史，其为NMOSD(视神经脊髓炎谱系障碍)的诊断、治疗和预后提供了一个新的方向。近年国外报道，在NMO患者血清中可检测到高度特异的NMO-IgG，有助于早期诊断。

目前的功能研究中，可以通过瞬时转染的方式将外源基因导入细胞，再使用表达人AQP4蛋白的细胞作为底物，来检测人血清中NMO-IgG的存在与否。但是，这一实现方式具有外源基因表达持续时间短的缺陷。

发明内容

本发明提供了用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法，外源基因能够长时间稳定表达。

第一方面，本发明提供了用于检测NMO-IgG的稳转细胞株的构建方法，包括：

(1)构建过表达载体：

利用包含两个酶切位点的引物对，PCR扩增AQP4 M1基因，得到AQP4M1 PCR产物；

利用与两个酶切位点相对应的限制性内切酶，分别酶切AQP4 M1 PCR产物和慢病毒载体；

连接AQP4 M1 PCR产物的酶切产物和慢病毒载体的酶切产物，得到过表达载体；

利用连接得到的过表达载体，转化感受态细胞；

利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素筛选转化后的感受态细胞，对筛选出的单菌落作扩增培养并从中提取过表达载体，电泳初筛提取的过表达载体并在初筛通过后送测序鉴定；

(2)包装慢病毒：

利用通过测序鉴定的过表达载体和慢病毒包装载体共转染细胞，细胞内包装慢病毒，浓缩纯化慢病毒，并以带荧光标记的空载体作对照；

(3)慢病毒转导细胞：

利用慢病毒转导细胞，并通过观察空载体的细胞荧光发光情况，来评估转导后细胞的病毒滴度；

(4)筛选稳转细胞株：

评估通过后，利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素持续作用转导后的细胞，以筛选出稳转细胞株并保存。

详细地，在中枢神经系统中AQP4主要有两种亚型：AQP4 M1、AQP4M23。AQP4 M1作为AQP4的其中一个亚型，有较高的敏感性及特异性。