[发明专利]一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法

权利要求书

1.一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其包括如下步骤:

(1)提供一种用于制备测序文库的RNA样品,总体积为5μl,总量为2μg以上；

(2)提供一种用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为5’-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’；

(3)提供一种用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为11～15个的随机核苷酸序列N_11-15，S2定义为随机标签序列，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一种；

(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；

(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；

(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链，其中反转录引物RTPrimer的序列为5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’；

(7)从步骤(6)获得的含有DNA第一链的溶液中按照体积比例取出6份，使它们的体积分别占原溶液的1/2,1/5,1/10,1/20,1/50和1/100,随后用水分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍至与原溶液相等体积,并将稀释后的含有DNA第一链的溶液依次标记为样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H；

(8)将步骤(7)获得的样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H分别与特异性结合于衔接子RA3相应区域的引物Primer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的引物Primer2进行混合,进行PCR反应,获得扩增产物；其中，Primer1的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’，Pr imer2的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’，其中标下划线的8个碱基“GTCGTGAT”为index序列，所述的index序列至少还可用以下十种index序列替换：ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；样品C-H中的每个样品选择使用一个index序列，且不同的样品使用的index序列各不相同，较为具体的，样品C-H选择的index序列包括但不限定于GTCGTGAT、ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；

(9)将步骤(8)获得的6份扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳,胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带,割取所需的目的DNA片段并回收,此即制备完成的测序文库,通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行片段长度范围检测和Invitrogen Qubit进行定量之后即可用于Illumina高通量测序平台直接测序；其中，测序读长在50bp到150bp之间，测序模式为单端测序或者双端测序；所述的目的DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+S2的长度+S3的长度，其中，所述的miRNA的长度为15～30bp，且所述的miRNA平均长度为22bp，测序接头的长度为120bp，S2的长度为11～15bp，S3的长度为4bp；所以，理论上，目的DNA片段的长度分布在22bp+120bp+S2+4bp±10bp之间，因此，切胶范围设定为22bp+120bp+S2+4bp±10bp，即S2+146bp±10bp；

(10)根据测序接头中用于区分不同样品的index序列将步骤(9)产生的测序数据拆分,随后使用软件，所使用的软件为：FastQC、Cutadpat、Trimmomatic，对样品C-H的测序数据进行质控和预处理以得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据；随后将RA5中的随机标签序列S2以及固定碱基S3从有效数据的序列5’端移除；随后使用序列比对软件Bowtie将得到的序列再比对到参考基因组序列上,获得定位于参考基因组的位置信息；所述参考基因组包括但不限于人类和小鼠的参考基因组；

(11)根据步骤(10)获得的序列比对位置以及对应的随机标签序列S2,对样品C-H分别进行PCR重复序列的去除，具体而言,被序列比对软件比对到参考基因组同一位置的序列若带有相同的随机标签序列S2,则视为PCR重复，所述同一位置的序列即序列的5’和3’端在参考基因组的位置相同的序列,并将其合并为同一条序列；

(12)将步骤(11)中获得的已去除PCR重复的序列的位置与参考基因组中的miRNA位置相比较,所述miRNA均指成熟miRNA，确定样品C-H中所有miRNA的表达量；

(13)通过对样品C-H中miRNA表达量的比较，从而对样品C-H的高表达丰度的miRNA进行表达量的校正。