[发明专利]一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法

说明书

为了解决miRNA的精确定量问题，本发明提供一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其主要步骤包括在RNA两端连接衔接子RA5与RA3；使用反转录引物RT Primer获得DNA第一链并对溶液进行不同倍数的稀释；使用Primer1和Primer2进行PCR并对扩增产物中目的DNA片段进行切胶回收；使用Illumina测序平台进行测序；使用生物信息学工具分析下机数据并使用算法校正miRNA的表达量。本发明设计的包含随机标签序列的衔接子RA5能有效去除PCR扩增带来的重复序列，实现对miRNA进行更为精准的表达定量；本发明提出的稀释法以及对应的算法，有效避免了因miRNA的不同拷贝连接上同样的随机标签序列而造成表达量低估的情况，因此进一步提高了定量的准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于精确定量miRNA(英文全称为microRNA，中文名称为微小RNA)的高通量测序文库的制备和分析方法。

背景技术

miRNA是一类平均长度仅为22个核苷酸的非编码RNA,在细胞内发挥重要的生物学功能。目前市场上用于miRNA高通量文库制备的主流试剂盒，如Illumina公司和NEB公司的miRNA建库试剂盒，构建的测序文库都难以实现精准定量，其结果往往和qPCR定量(qPCR的英文全名为Real-time Quantitative PCR Detecting System，中文解释为实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统)结果有一定的差距。尽管SaifulIslam等人报道的针对单细胞测序的定量化标签方法(Nature Methods,2014,11:163-166)能大幅提高定量的准确性，但此法不适用于取自大量细胞的RNA样品的建库和定量分析。目前，有人提出在miRNA文库制备过程中加入随机标签序列以实现精确定量的效果。尽管此方法在整体上大幅的提高了miRNA的定量精确度，但在定量某些表达丰度很高的miRNA时，效果仍然不够理想。综上所述，为了实现对miRNA的精确定量，特别是表达丰度很高的miRNA的精确定量，目前需要建立一种高通量测序文库的制备和分析方法，以更好地满足精准医学和定量生物学的实际需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法。其步骤如下:

(1)提供一种用于制备测序文库的RNA样品,总体积为5μl,总量为2μg以上；

(2)提供一种用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为5’-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’；

(3)提供一种用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为11～15个的随机核苷酸序列N_11-15，S2定义为随机标签序列，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一种；

(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；

(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；

(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链，其中反转录引物RTPrimer的序列为5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’；