[发明专利]一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因、异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的重组菌，出发菌株为大肠杆菌；

所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因或来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因；所述来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述法尼基二磷酸合成酶ispA基因核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；所述来自青蒿的β-法尼烯合成酶AaFS基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

2.根据权利要求1所述的高产法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因时，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的拷贝数均为1个或者均为2个；所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因时，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的拷贝数均为1个。

3.根据权利要求1所述的高产法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

4.权利要求1-3任意一项所述的高产法尼烯的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS构建：将所述β-法尼烯合成酶AaFS基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，采用酶切-连接的方式构建到pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1载体上，获得质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS；

2)质粒pTrcLower-ΔIDI构建：敲除pTrcLower载体中来自酵母的异戊烯基二磷酸异构酶ScIDI基因，得到含有ERG12、ERG8和ERG19基因的质粒pTrcLower-ΔIDI；

3)质粒pTrcLower-AaIDI构建：将来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，采用酶切-连接的方式构建到pTrcLower载体上，获得质粒pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-AaIDI即pTrcLower-AaIDI；

4)质粒pET28a-AaFS-ispA-IDI构建：

分别扩增pET28a载体序列、AaFS基因、ispA基因、来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列和来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因，通过Gibson Assembly方法分别构建获得质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI和质粒pET28a-AaFS-ispA-SlIDI；

5)质粒转化：

将质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到的pET28a-AaFS-ispA-AaIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含青蒿来源AaIDI基因的单拷贝基因工程菌；

将质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到的pET28a-AaFS-ispA-SlIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含番茄来源SlIDI基因的单拷贝基因工程菌；

将步骤1)制备的质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS、步骤3)制备的质粒pTrcLower-AaIDI和步骤4)制备的质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含青蒿来源AaIDI基因的双拷贝基因工程菌。