[发明专利]一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用，属于微生物技术领域。为了解决大肠杆菌合成法尼烯过程中存在的异源MVA下游途径催化效率低、法尼烯产量低等问题，本发明构建了质粒pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA‑AaFS、pTrcLower‑ΔIDI、pTrcLower‑AaIDI和pET28a‑AaFS‑ispA‑SlIDI/AaIDI(IDI基因分别来自番茄、青蒿)，将以上质粒进行组合后转化大肠杆菌，并改良培养条件，制备的基因工程菌可显著提高法尼烯合成产量，有利于推动生物法合成法尼烯的工业化进程。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

法尼烯(farnesene)，分子式C₁₅H₂₄，又称金合欢烯，是一种链状倍半萜烯。法尼烯因具有芳香气味和抗氧化等活性，可作为添加剂应用于日化、医药、食品等工业；还可作为信息素，应用于农业害虫的生物防治；此外，法尼烯还是合成维生素E侧链的重要中间体。近年来，萜烯类生物燃料越来越受到关注。法尼烯的加氢产物法尼烷(farnesane)因具有高十六烷值和较低的碳排放，被认为是极具潜力的航空航天领域新型生物燃料。

天然法尼烯存在于多种植物精油中，其合成的直接单体异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)主要来自于上游的甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythrito-4-phosphate,MEP)途径。IPP和DMAPP经法尼基二磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS/IspA)催化缩合，再经过法尼烯合成酶(farnesene synthase,FS)催化生成法尼烯。植物中法尼烯含量低，提取成本高，易受原料限制；而化学法合成法尼烯需要专门仪器设备，步骤复杂，能耗高，易产生污染。随着基因工程和合成生物学的发展，利用工程微生物来生产法尼烯已经实现。通过引入外源途径，利用大肠杆菌(Escherichia coli)合成法尼烯的产量在摇瓶水平达到5.40g/L(发酵96h)，在发酵罐水平达到8.74g/L(发酵120h)。通过改造内源途径和引入合成酶，利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)合成法尼烯的产量在20万升工业级发酵罐水平达到130g/L以上(发酵两周)。鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)仅利用二氧化碳、光照和微量元素合成法尼烯的产量达到69.1±1.8μg·L^-1·O.D.^-1·d^-1。

大肠杆菌与酵母相比具有生长速度快、培养容易、遗传操作简单等优点，减少了发酵周期长带来的染菌风险。由于法尼烯本身对宿主细胞没有毒害作用，其在大肠杆菌中的产量有望通过关键酶优化、培养条件优化等手段得到进一步提高。

发明内容

为了解决大肠杆菌合成法尼烯过程中存在的异源MVA下游途径催化效率低、中间代谢产物如IPP/DMAPP对宿主有毒性以及法尼烯产量如何进一步提升的问题，本发明采用技术方案如下：

本发明提供了植物来源的异戊烯基二磷酸异构酶(isopentyl diphosphateisomerase,IDI)，相比于大肠杆菌来源的催化活性更高；并通过增加关键基因IDI、ispA和AaFS的拷贝数来提高MVA下游途径的催化效率和减少有毒中间产物的积累。利用酶切-连接的方法构建了pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS和pTrcLower-AaIDI质粒，利用吉布森组装(Gibson Assembly)的方法构建了质粒pTrcLower-ΔIDI和一系列pET28a-AaFS-ispA-SlIDI/AaIDI质粒(IDI基因分别来自番茄、青蒿)。将以上质粒进行组合后转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别进行了摇瓶发酵。通过IPTG诱导表达和TRPO原位萃取获得含有法尼烯的样品，通过气相色谱和法尼烯标准品曲线对样品进行定量分析。