[发明专利]禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法

权利要求书

1.禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；

下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'。

2.禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。

3.植物植物禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物及探针组合，其特征在于，包括：

上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；

下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'；

探针：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'。

4.一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物、及权利要求2所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQID NO:4所示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为ddH₂O。

7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×Probe Mix。

8.一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：

上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；

下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'；

探针：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'；

模板：如SEQ ID NO:4所示；

优选地，还包括阴性对照样品，进一步优选地，所述阴性对照样品为ddH₂O。

9.一种检测植物禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1.提取待测样品总DNA；

步骤2.制备反应体系，所述反应体系如权利要求8所述；

步骤3.将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；

步骤4.将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；

步骤5.绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果；

优选地，所述步骤3中，梯度稀释制得的标准曲线样品的浓度分别为3.17×10⁹copies/μL、3.17×10⁸copies/μL、3.17×10⁷copies/μL、3.17×10⁶copies/μL、3.17×10⁵copies/μL、3.17×10⁴copies/μL、3.17×10³copies/μL、3.17×10²copies/μL、3.17×10¹copies/μL；

优选地，所述阳性对照样品的浓度为3.17×10¹⁰copies/μL。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，PCR的反应条件为：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃15s、60℃20s、72℃40s并收集荧光信号，40个循环。