[发明专利]禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了禾谷镰刀菌的RT‑QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法，属于生物技术领域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；试剂盒包括上述引物及探针。荧光定量PCR检测方法包括：提取待测样品总DNA；制备反应体系；将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用引物和探针进行荧光定量PCR扩增；绘制标准曲线，计算结果。本发明的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地禾谷镰刀菌进行检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及禾谷镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起小麦、燕麦、大麦、玉米等发生赤霉病，该病菌主要危害粮食作物穗部，使受害穗子粒变色，皱缩，粒重下降，进而引起产量下降。此外，禾谷镰刀菌也是玉米贮存过程中污染程度最严重的真菌菌群之一。由禾谷镰刀菌产生的次级代谢物霉菌毒素-赤霉烯酮能引起人畜中毒并有致癌作用，当前鉴定禾谷镰刀菌主要依靠其菌丝体及再生菌丝的形态结构学特征或对寄主植物接种根据其病害症状特征来进行判定，这些鉴定方法相对简单但需要较长的时间在很大程度上利用检测人员的经验。

现有技术中，采用多重PCR检测禾谷镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，RT-QPCR (实时荧光定量PCR)目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。但禾谷镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、尖孢镰孢。因此提供一种用于禾谷镰刀菌的PCR检测方法，具有高度特异性，准确度高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，特异性好，准确度高。

本发明的目的之二在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的探针。

本发明的目的之三在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒。

本发明的目的之四在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明通过对NCBI数据库中禾谷镰刀菌ITS基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，并进一步应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测植物禾谷镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。

本发明所述的禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，该引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；

下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'。

本发明所述的禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，该探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3 所示：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM， 3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。

ITS基因广泛存在于禾谷镰刀菌中，具有很高的保守性。本发明采用禾谷镰刀菌ITS基因作为靶序列，合成了引物及探针。