[发明专利]一种用于检测尿液BK病毒的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种用于检测尿液BK病毒的试剂盒，其中包括2×Taq Mix、BK病毒扩增引物、ddH₂O；

所述BK病毒扩增引物为：

F：GGGCAGCGCACGATGTTTT；

R：AGCTGCCCCTGGACACTCT。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测尿液BK病毒的试剂盒，其特征在于：所述2×TaqMix包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料。

3.一种根据权利要求1所述的用于检测尿液BK病毒的方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：

步骤一：待测样本的获取：从待测尿液中提取BK病毒的DNA，获得待测样本；

步骤二：PCR反应液的配置：分为阳性对照管、样本管和阴性对照管，总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、BK病毒扩增引物F 2μL、BK病毒扩增引物R 2μL、样本DNA2μL、ddH₂O补至50μL；

步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数；

步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与对照大小相同的条带回收；

步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；

步骤六：与BK病毒的序列进行比对，如果一致，则指示该样品中存在BK病毒，如不一致或者样本管中无与阳性对照相同大小的条带，则指示该样品中不存在BK病毒。

4.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液BK病毒的方法，其特征在于：所述步骤二中阳性对照管中DNA样为含有BK病毒的DNA。

5.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液BK病毒的方法，其特征在于：所述步骤二中阴性对照管中DNA样为ddH₂O。

6.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液BK病毒的方法，其特征在于：所述步骤三中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，循环次数为35次；72℃，10min。

7.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液BK病毒的方法，其特征在于：所述步骤一从尿液中提取DNA具体步骤为：

裂解：对样本中加入200μL裂解液，20μL biog复合消化液，充分混匀，56℃温育12分钟；

结合：冷却到室温，加入300μL异丙醇，充分混匀，再加入20μL磁珠复合液，振荡混匀3min，静止2min，然后将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液；

洗涤：加入800μL配制后的洗涤液，将离心管从磁力架上取下，充分振荡2min，确保磁珠完全分散。将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液，将离心管从磁力架上取下，开盖，干燥约3-5min，至无明显乙醇气味；

洗脱：加入50-100μL洗脱液，振荡至磁珠充分散开，室温静置2min，再振荡混匀1min；

DNA的获得：将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，小心吸取上清液至一新的1.5mL离心管中，提取的核酸可直接用于下游实验，或-20℃保存备用。