[发明专利]一种人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分制备方法、用途

权利要求书

1.一种人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

取人源皮肤成纤维细胞用0.9％的生理盐水调整细胞浓度为1-3×10⁶个/mL，体积为10-20mL，放置于-80℃冰箱30min冰冻，然后取出置于37℃水浴中30min，溶解后，超声震荡5min，反复3-5次，细胞完全裂解，收集细胞裂解液，即细胞碎片和细胞内溶物；

将所得细胞裂解液于常温，4000r/min条件下离心10-20min，取上清液，并用0.22μm滤膜过滤，随后加入0.9％的生理盐水，调整至10-20ml，制得成纤维细胞胞内有效成分。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人源皮肤成纤维细胞的获取，包括如下步骤：

将获取的人腹部全层皮肤，置于含100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的PBS缓冲液中反复漂洗30-50次，去除皮下脂肪及多余组织；

将上述皮肤剪成1-3mm³小块，真皮侧贴于培养瓶，加入2mg/mL的Ⅱ型胶原酶2-3mL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中消化12-15小时；

取出消化后的皮肤，小心取出表皮组织，剩余部分用含100U/mL青霉素和100g/mL链霉素PBS缓冲液中反复漂洗5-10次，并彻底剪碎；

然后加入2mg/mL的Ⅱ型胶原酶3-5mL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中消化4-5小时；

将消化后的皮肤，用100目过滤筛过滤，PBS清洗3-5次，通过贴壁筛选，获得成纤维细胞。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将获得的成纤维细胞进行传代培养，包括：用含100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的无血清培养基调整细胞浓度为1-3×10⁶个/mL，于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，观察细胞生长状况，当细胞密度为80％左右时，对细胞进行传代培养，收集第四代细胞，备用。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将第四代成纤维细胞用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化3-5min，并将消化后的细胞1000-2000r/min离心5-10min，所得沉淀用0.9％的生理盐水进行洗涤3-5次。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分。

6.一种人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分冻干粉的制备方法，其特征在于，将人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分中加入植物提取物，然后进行冻干。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述冻干粉的配方为：人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分30-50mL、木兰树皮提取物0.1-0.5mL、芦荟提取物0.1-0.2mL、仙人掌提取物0.1-0.2mL和玫瑰花提取物0.1-0.3mL。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述冻干的条件为：压强为20pa，-40℃下5h，-25℃下4h，10℃下2h，0℃下2h，25℃下6h。

9.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分、权利要求5所述的人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分或权利要求6-8任一项所述的制备方法得到的人源皮肤成纤维细胞胞内有效分冻干粉具有如下任意一项的用途：

(1)在延缓皮肤衰老中的用途；

(2)在修复皮肤受损中的用途；

(3)在制备延缓皮肤衰老或修复皮肤受损的化妆品中的用途；

(4)在制备延缓皮肤衰老或修复皮肤受损的药物中的用途。

10.一种延缓皮肤衰老或修复皮肤受损的化妆品或药物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分、权利要求5所述的人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分或权利要求6-8任一项所述的制备方法得到的人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分冻干粉。