[发明专利]一种人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分制备方法、用途

说明书

本发明属于皮肤修复领域，具体涉及到一种人源皮肤的成纤维细胞细胞胞内有效成分制备方法及用途，并且与植物提取物混合制作冻干粉，可以用于肌肤护理用品的添加，达到保护肌肤的作用。通过酶消化法获取人源皮肤成纤维细胞，反复冻融使细胞裂解，收集细胞胞内因子并补充植物提取物，两者可以相互促进，稳定并维持有效成分，补充肌肤所需成分，并维持肌肤活力。

技术领域

本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及一种人源皮肤的成纤维细胞细胞胞内有效成分及其制备方法、用途。

背景技术

人源皮肤成纤维细胞是组成皮肤真皮的主要结构成分，关系到皮肤的衰老及修复，它可以合成和分泌有效成分，对于维持皮肤的稳定具有重要作用。皮肤中胶原蛋白和许多细胞修复因子，大都都来于成纤维细胞，对于维持皮肤的活性具有重要作用。

单一有效成分的缺失，往往可以通过添加相应细胞因子或多肽，维持皮肤的平衡。但是如何找到缺少成分，往往是根据经验，这对于皮肤的修复不能达到很好的修复。如果缺少几种，则对于皮肤的补充就更加困难。越来越多的研究表明，植物精华对于皮肤活性的维持作用，将纤维细胞的胞内有效成分，配合植物精华，保护肌肤，并维持、修复肌肤问题，变得十分必要。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种人源皮肤的成纤维细胞细胞胞内有效成分及其制备方法、用途，制备得到的人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分配合植物精华应用于化妆品中，皮肤在修复的同时，保持肌肤活力。

为此，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种人源皮肤成纤维细胞胞内有效成分的制备方法，包括如下步骤：

取人源皮肤成纤维细胞用0.9％的生理盐水调整细胞浓度为1-3×10⁶个/mL，体积为10-20mL，放置于-80℃冰箱30min冰冻，然后取出置于37℃水浴中30min，溶解后，超声震荡5min，反复3-5次，细胞完全裂解，收集细胞裂解液，即细胞碎片和细胞内溶物。

细胞裂解液于常温，4000r/min条件下离心10-20min，取上清液，并用用0.22μm滤膜过滤，随后加入0.9％的生理盐水，调整至10-20ml，制得成纤维细胞胞内有效成分。

在所述的制备方法中，所述人源皮肤成纤维细胞的获取，包括如下步骤：

将获取的人腹部全层皮肤，置于含100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的PBS缓冲液中反复漂洗30-50次，去除皮下脂肪及多余组织；

将上述皮肤剪成1-3mm³小块，真皮侧贴于培养瓶，2mg/mLⅡ型胶原酶2-3mL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中消化12-15小时；

取出消化后的皮肤，小心取出表皮组织，剩余部分用含100U/mL青霉素和100g/mL链霉素PBS缓冲液中反复漂洗5-10次，并彻底剪碎；

然后加入2mg/mL的Ⅱ型胶原酶3-5mL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中消化4-5小时；

将消化后的皮肤，用100目过滤筛过滤，PBS清洗3-5次，通过贴壁筛选，获得成纤维细胞。

在所述的制备方法中，将收集的细胞进行传代培养，包括：用含100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的无血清培养基调整浓细胞度为1-3×10⁶个/mL，于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，观察细胞生长状况，当细胞密度为80％左右时，对细胞进行传代培养，收集第四代细胞，备用。

将第四代成纤维细胞用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化3-5min，并将消化后的细胞1000-2000r/min离心5-10min，沉淀用0.9％的生理盐水进行洗涤3-5次。