[发明专利]一种猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及方法在审
| 申请号： | 202010374676.2 | 申请日： | 2020-05-06 |
| 公开（公告）号： | CN111621596A | 公开（公告）日： | 2020-09-04 |
| 发明（设计）人： | 杨斌;黄红亮;陈瑞爱 | 申请（专利权）人： | 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 广州市科丰知识产权代理事务所(普通合伙) 44467 | 代理人： | 龚元元 |
| 地址： | 526060 广东省肇庆市高新区创业路5*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种猪 圆环 病毒 实时 荧光 定量 pcr 检测 引物 探针 试剂盒 方法 | ||
1.一种猪圆环病毒3型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测引物和探针组，其特征在于，所述检测引物和探针组的核苷酸序列如下所示：
上游引物PCV3-F1：5’TAAACGAATGGGAAACTGCC 3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物PCV3-R1：5’TTCCGCATAAGGGTCGTCT 3’(SEQ ID NO：2)；
荧光探针PCV3-Pn：5’CACTCAGCCCTGTAAT 3’(SEQ ID NO：3)。
2.一种猪圆环病毒3型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测引物和探针组。
3.根据权利要求2所述的一种猪圆环病毒3型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含反应混合液和ddH2O。
4.一种利用权利要求1所述的引物和探针组检测猪圆环病毒3型的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取猪圆环病毒3型病料组织中的病毒DNA；
(2)将步骤(1)中的病毒DNA使用引物PCV3-F1和PCV3-R1进行PCR扩增，胶回收并纯化PCR扩增产物，将回收纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌JM109，得到重组标准质粒pMD18-T-JM109；
(3)将步骤(2)制得的重组标准质粒pMD18-T-JM109作为标准品，测定其浓度并计算起始质粒拷贝数，然后进行10倍梯度稀释；
(4)将步骤(3)中各稀释梯度的标准品及待测样品分别作为反应模板进行TaqMan实时荧光定量PCR反应，建立猪圆环病毒3型TaqMan实时荧光定量PCR检测的标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中猪圆环病毒3型核酸拷贝数，即为猪圆环病毒3型的含量。
5.根据权利要求4所述的一种猪圆环病毒3型的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述TaqMan实时荧光定量PCR反应体系为：浓度为2x的反应混合液10μL，浓度均为10μM的引物PCV3-F1、PCV3-R1、探针PCV3-Pn各0.4μL，ddH2O7.8μL，DNA模板1μL。
6.根据权利要求4所述的一种猪圆环病毒3型的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述TaqMan实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环。
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