[发明专利]一种猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及方法

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及方法。本发明首次通过在PCV3 cap蛋白上设计引物增强了检测的准确性；该检测方法实现了全闭管式操作，减少了假阳性现象的出现，同时TaqMan探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性既克服了常规PCR技术只能实现定性检测的不足，又解决了SYBR Green法特异性不强等缺点，更加适应临床检测；该方法灵敏度高，特异性和重复性较好，最低检测下限为11.8拷贝/μL，与其他荧光定量PCR检测方法相比检测更灵敏。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是1974年由德国学者Tischer等从猪传代肾细胞系PK-15中首次分离出来的。PCV是迄今为止发现的最小的动物病毒，病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称；属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属，是单股环状DNA病毒，无囊膜。根据其发现的先后、致病性和基因组序列等差异，目前一共有三种类型的圆环病毒，分别是PCV1(Porcine circovirus 1)、PCV2(Porcine circovirus 2)和PCV3(Porcinecircovirus 3)。PCV1最早发现对猪不具有致病性。而随后发现的能引起猪发病的PCV，称其为PCV2。PCV2已被证明是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning mμLtisystemic wasting syndrome，PMWS)等疾病的的主要病原体，自1991年在加拿大断奶仔猪群中首次报道PMWS以来，该病目前已呈世界流行；主要的临床症状包括消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、增重迟缓、皮肤苍白等。PCV2可造成猪的抵抗力下降，损伤机体的免疫系统，以淋巴结肿大、淋巴细胞减少等为主要特征，导致严重的免疫抑制，给世界养猪业带来巨大的经济损失。根据文献报道，PCV2有五种基因亚型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e，PCV2d序列最早在中国被发现，目前有研究证明，多个国家和地区的PCV2流行基因型已由PCV2b转变为PCV2d。最近在美国和墨西哥的病料中检测到PCV2e，它的全基因序列1777bp。2016年在美国猪群中首次发现了一种新的圆环病毒，PCV3(Porcine circovirus 3)，并且PCV3可能与猪皮炎与肾病综合征(Porcine Dermatitis Nephropathy Syndrome，PDNS)、母猪繁殖失败、流产等临床症状相关。2017年，在国内也有相应的文章报道了PCV3的出现，但是到目前为止关于PCV3的报道依旧很少，加大对PCV3的研究势在必行。

目前对PCV3检测普遍应用的是常规PCR的方法，该方法虽然简单、方便、快速、敏感，但是仍然存在假阳性、易漏检、PCR污染等缺陷。近年来，SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法因为操作简单、快速、灵敏度高、重复性好、不易污染和可自动定量分析等优点，被越来越多地应用于PCV3的检测，但是由于染料能够与任意DNA双链结合发光，所以很容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，导致特异性较差。TaqMan探针实时荧光定量PCR的原理是：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。TaqMan探针法实现了全闭管式操作，减少了假阳性现象的出现，同时探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性既克服了常规PCR技术只能实现定性检测的不足，又解决了SYBR Green法特异性不强等缺点，更加适应临床检测。