[发明专利]环糊精葡萄糖基转移酶突变体T383A及其制备方法

说明书

本发明公开了环糊精葡萄糖基转移酶突变体T383A及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过对环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到了环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力更高的突变体。突变T383A的摇瓶发酵酶歧化活力分别为野生酶的1.32倍。本发明对环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高了该酶的在食品、医药、化工行业中的应用潜力。

技术领域

本发明涉及环糊精葡萄糖基转移酶突变体T383A及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称CGTase，EC2.4.1.19)是α-淀粉酶家族(GH13)中的主要成员。它作为一种多功能酶，可催化四种不同的反应，包括三种转糖基(transfructosylation，又称转糖苷)反应-歧化反应、环化反应和偶合反应以及一种水解反应。其中，歧化反应占据主导地位，该反应是将直链低聚糖被切断的部分转移到另一受体上，是一种分子外转糖基反应；环化反应作为一种分子内转糖基反应，这是CGTase的特征反应，其原理是将直链麦芽低聚糖上非还原端的O4或C4上的糖苷转移到同一直链还原端的C1或O1上。环化反应的逆反应就是偶合反应，它可以打开环糊精的环，将糖苷转移到直链麦芽低聚物上。CGTase同时具备催化环化反应和耦合反应的活性，是导致其在催化淀粉发生反应的过程中，随着时间延长，产物逐渐由α-环糊精向β-环糊精转变的原因。CGTase催化淀粉发生水解反应时，是将直链淀粉分子切断以后，将断开的两端分子都转移到水分子上，完成水解反应；CGTase催化水解反应的活性较弱。

CGTase的应用比较广泛，最常见的就是通过环化反应把淀粉转化为环糊精。根据生成的环糊精种类的不同，可以把CGTase分为α-CGTase、β-CGTase、γ-CGTase，此外，还有报道显示CGTase能催化淀粉生产8个葡萄糖单元以上的环糊精。通过歧化和耦合反应，CGTase可以将转化淀粉或环糊精生成的单糖或低聚糖作为供体提供给各种受体分子，以改善其特性。例如，通过CGTase的歧化和偶合反应将小分子糖转移到蔗糖或果糖上而生产抗龋齿功能偶合糖；对甜菊苷、芸香苷、鼠李糖等物质进行糖基化修饰，显著改善其性能，使之可更加广泛地应用于食品、医药、化工等领域。

Bacillus circulans 251来源的CGTase是一种典型的β-CGTase，其优秀的转糖基性能可被应用多个领域。但是，该CGTase歧化活力(约40U/mL)较其他来源的CGTase低，提高该酶歧化活力势在必行。

发明内容

发明所要解决的一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的一个或多个氨基酸位点进行突变；这些位点包括：第6位的缬氨酸(Val)、90位的丝氨酸(Ser)、168位的苏氨酸(Thr)、171位的苏氨酸(Thr)、383位的苏氨酸(Thr)、608位的甘氨酸(Gly)。所述突变体催化歧化反应的活力有所提高。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于环状芽孢杆菌(B.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码所述来源于环状芽孢杆菌(B.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第6位的缬氨酸(V)突变为天冬氨酸，命名为V6D。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第90位的丝氨酸(T)突变为甘氨酸，命名为S90G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第168位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸，命名为T168A。