[发明专利]一种基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，包括分开设置的第1-9号试剂包，所述1-9号试剂包的每一个包含引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述引物对和探针至少包含以下各个融合基团对应的序列：

2.根据权利要求1所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述探针为Taqman探针，在其核酸的5’端连接有荧光报告基团，在其核酸的3’端连接有荧光淬灭基团，且三个探针的荧光报告基团不同。

3.根据权利要求2所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX中的任一种。

4.根据权利要求2所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

5.根据权利要求1所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述试剂盒的第7号试剂包还包含内标系统，所示内标系统是根据内参基因GAPDH序列设计的内标引物和内标探针，所述内标引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.133所示，所述下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.134所示，所述内标探针的核酸序列如SEQ ID NO.135所示。

6.根据权利要求5所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述内标探针为Taqman探针，在其核酸的5’端连接有荧光报告基团ROX，在其核酸的3’端连接有BHQ1荧光淬灭基团。

7.根据权利要求1所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含荧光PCR反应液，所述荧光PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTP、Hot Start TaqDNA聚合酶、UNG酶以及MgCl₂。

8.根据权利要求1所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第10号试剂包，所述第10号试剂包是阴性对照，所述阴性对照是体积为5ul的RNase Free H₂O。

9.根据权利要求1所述的基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第11号试剂包，所述第11号试剂包是阳性对照，所述阳性对照为含有常见融合基因类型的cDNA混合液。

10.一种白血病融合基因的检测方法，该方法包括以下步骤：

S1、细胞培养：按照细胞培养的标准操作在细胞间培养K562细胞系、Kasumi细胞系、NB4细胞系、THP-1细胞系以及HL60细胞系，培养条件为37℃、5％CO₂；

S2、RNA的提取：获取待测样品的核酸，核酸的提取采用Trans RNA Pure Blood Kit试剂盒获得细胞系中的RNA；

S3、RNA的逆转录：使用Promega GoScript^TMReverse Transcriptase试剂盒获得cDNA；

S4、荧光PCR扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤S3中获取的cDNA为模板，进行PCR扩增，并收集荧光信号；

荧光PCR扩增的体系组成及含量为：

荧光PCR的反应条件为：先经过50℃2min的UNG反应，然后95℃10min；再然后经过95℃15s，60℃30s，共45个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号；

S5、数据收集处理和分析：首先分析第7号试剂包内内参基因GAPDH的扩增信号，如果其C_T值小于30，表明整个检测过程有效；如果其C_T值大于30，则需要重新验证检测。