[发明专利]一种基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒及方法

说明书

本发明涉及生物技术领域中白血病融合基因的基因检测，尤其是涉及一种对白血病中常见的55种融合基因的多重荧光RT‑PCR检测方法，优选的使用FAM、VIC、ROX三重荧光通道。本发明利用多重荧光RT‑PCR技术高准确率、高特异性、高检出率筛查白血病患者中常见的融合基因，为血液病患者的诊断、预后分层和靶向治疗提供指导。

技术领域

本发明涉及一种白血病融合基因的检测，特别是涉及一种基于多重荧光RT-PCR检测白血病融合基因的试剂盒及方法。

背景技术

白血病是一种骨髓造血干细胞恶性克隆性增生的疾病，尤其在儿童和青年中最为常见。白血病中具有明确病理意义的重现性的融合基因是导致白血病发生及发展的主要变异，并且伴随着白血病细胞稳定存在。WHO 2016版血液肿瘤分类标准中所提到的融合基因已有一百多种，基因突变也有一百多种。目前，在白血病中常见的经典融合基因有：BCR-ABL1、AML1-ETO、PML-RARA、CBFB-MYH11、MM-AF4、E2A-PBX1等。融合基因的鉴定为血液肿瘤的诊断、分型、临床治疗方案的选择、疗效监测和靶向药物的研发提供了重要的分子指标。

融合基因的检测可以辅助临床诊断。其中PML-RARA融合基因多出现于急性髓系白血病的M3当中，尤其是早幼粒细胞白血病(APL)。CBFB-MYH11融合基因往往出现于AML-M4中。BCR-ABL1融合基因见于95％的CML、约3％的AML和20％的ALL(儿童仅为2-5％)。AML1-ETO融合基因见于12％的AML中，M2亚型占40％。儿童B-ALL中常见的四大融合基因类型包括TEL-AML1、E2A-PBX1、BCR-ABL、MLL-AF4。

融合基因的检测可以辅助临床预后的评估。伴随AML-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARA融合基因的患者预后一般较好，而伴随BCR-ABL1、DEK-CAN融合基因患者被列入到预后较差(不良)组。在儿童B-ALL中TEL-AML1阳性、E2A-PBX1阳性患者预后较好，临床危险度分层划为低危，而BCR-ABL1阳性、MLL-AF4阳性患者在临床上被划为高危。

融合基因的检测可以辅助临床靶向用药的指导。AML中伴随PML-RARA融合基因存在时，NCCN指南明确建议患者选用砷剂联合维甲酸进行治疗，而且约95％的患者都可以达到完全缓解；伴有BCR-ABL1融合基因的患者，建议使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)进行靶向治疗；靶向药物包括伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼等，使得携带BCR-ABL1融合基因的原本属于预后较差组的AL患者的无疾病进展生存期和生存期明显得到明显改善。

用于检测融合基因的方法主要包括染色体核型分析、荧光原位杂交(FISH)、实时荧光PCR(RQ-PCR)以及二代测序(NGS)。与染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比较，实时荧光PCR检测的灵敏度达到10-5-10-6，可以进行更快速、更精准的检测融合基因，这也是NCCN指南、ELN指南以及专家共识中所推荐的检测融合基因行之有效的方法。二代测序技术虽然灵敏度也可以达到10-5-10-6，但是由于高昂的成本及较长的检测周期限制了其在融合基因检测中的应用。多重荧光RT-PCR可以同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，尤其是适用于样本量比较少且检测靶标比较多的项目。因此多重荧光RT-PCR方法在白血病融合基因筛查方面有更大的应用价值。

目前临床上用于白血病融合基因全面筛查检测的定性试剂盒很少看到，科研文献中大多都是基于多重巢式RT-PCR和多重荧光RT-PCR方法，且多重荧光PCR的方法一般只能进行双重通道的检测，无法进行三重荧光通道的检测。

因此本发明在多重荧光RT-PCR的基础上，优选的使用FAM、VIC、ROX三重荧光通道，快速、简便、低耗的完成白血病55种融合基因的筛查。本发明的检测试剂盒适用于慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性细胞白血病等所有的白血病，从而为白血病的定性检测诊断、辅助临床以及预后提供临床意义。

发明内容