[发明专利]一种修饰信号多肽ComX及其原核表达与纯化方法

权利要求书

1.一种修饰信号多肽ComX，其特征在于，所述多肽ComX的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述编码多肽ComX的comX基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种含有编码权利要求1所述修饰信号多肽ComX的comX基因的重组载体。

3.一种ComX原核表达菌株，其特征在于，包含权利要求2所述的重组载体。

4.一种制备权利要求3所述ComX原核表达菌株的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)提取枯草芽胞杆菌NCD-2基因组，之后依次进行PCR扩增、电泳回收、酶切并纯化，得到comQ基因片段和comX基因片段；

(2)将所述comQ基因片段和所述comX基因片段依次克隆至pETDuet1双表达载体上，并进行PCR验证，且测序验证正确即得到重组质粒pETDuet1-ComQComX；

(3)将所述重组质粒pETDuet1-ComQComX转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，得到所述ComX原核表达菌株。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的PCR扩增和步骤(2)中所述的PCR验证使用的引物均包括扩增comX基因片段的引物和扩增comQ基因片段的引物；所述comX基因片段的引物为ComX-F和ComX-R，基因序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；扩增comQ基因片段的引物为ComQ-F和ComQ-R，基因序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

步骤(1)中，所述PCR扩增的操作具体包括：使用全式金Fast PFU Fly Mix进行PCR扩增，扩增体系为50μL：Fast PFU Fly Mix 25μL、引物ComQ-F 1μL、引物ComQ-R 1μL、dd水22μL和枯草芽胞杆菌NCD-2基因组1μL，混合均匀；在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：94℃预变性3min；94℃变性20sec，60℃退火20sec，72℃延伸30sec；进行32个循环后，72℃延伸5min；

步骤(1)中，所述电泳回收操作具体为：将PCR扩增反应液进行1.0％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用生工凝胶回收试剂盒回收特异性片段，得到回收的comQ基因片段和回收的comX基因片段；

步骤(1)中，所述酶切包括获得comQ基因片段的酶切操作和获得comX基因片段的酶切操作；所述获得comQ基因片段的酶切体系包括：回收的comQ基因片段1μg、NcoI酶3μL、HindIII酶3μL、FD buffer 10μL，用水补足至100μL；所述获得comX基因的酶切体系包括：回收的comX基因片段1μg、NdeI酶3μL、KpnI酶3μL、FD buffer 10μL，用水补足至100μL；所述酶切条件为37℃水浴10min，完成酶切操作；所述纯化为：用生工PCR产物纯化试剂盒纯化酶切后的comQ基因片段和comX基因片段，得到comQ基因片段和comX基因片段；所述comQ基因片段具有NcoI和HindIII的粘性末端，所述comQ基因的基因序列如SEQ ID NO：7所示。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，具体操作为：使用T4连接酶将pETDuet1质粒与comQ基因片段进行连接，反应体系10μL：pETDuet1质粒1μL、comQ基因片段3μL、T4连接酶0.5μL、T4 buffer 1μL、水4.5μL，将反应体系置于22℃连接10min；之后取反应体系转化至50μl E.coli DH5α感受态细胞中，涂布在含有100μg/ml的氨苄抗生素的LB固体平板上培养12h，次日挑取单菌落进行PCR验证以鉴定阳性克隆菌，将所得阳性克隆菌株提取质粒进行DNA核苷酸序列测定，结果显示连接正确，得到pETDuet1-ComQ重组载体；以所述pETDuet1-ComQ重组载体为母本继续利用前述方法进行comX基因片段的连接、转化、测序，最终获得重组质粒pETDuet1-ComQComX。