[发明专利]H5和N8亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了H5和N8亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法，本发明设计针对H5和N8亚型AIV基因的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H5和N8亚型AIV的方法。本发明的引物和检测方法通过一次纳米PCR反应便可同时确定样品中H5与N8亚型AIV的混合感染及单一感染情况，特别是采用了纳米PCR这种新型的PCR技术，比普通PCR更敏感，比实时荧光定量PCR更方便快捷。该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H5与N8亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及H5和N8亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种高度传染性疫病，在全球范围内持续传播。禽流感病毒是正黏病毒科成员，根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase,NA)的差异可以将AIV划分为18种不同的HA亚型(H1～H18)和11种不同的NA亚型(N1～N11)。另外，依据其致病力的不同，还可将AIV分为高致病性AIV(HPAI)和低致病性AIV(LPAI)。影响最大的是H5亚型HPAI，已在60多个国家的家禽和野鸟中检测出该亚型病毒，而且H5亚型AIV不断进化、变异。目前，H5N8亚型AIV已经成为一种禽类之间的高度传染性病毒,对养禽业危害严重。从1878年第一次报道禽流感疫情以来，1983年H5N8疫情曾经在冰岛出现过流行。之后，H5N8亚型AIV于2010年首次在中国家禽中检测到，并于2014年初在韩国和日本的家禽中出现。至2014年末，HPAI H5N8病毒已传播到欧洲和北美洲。2020以来，世界动物卫生组织(OIE)通报沙特阿拉伯和匈牙利等国家家禽中再次爆发H5N8亚型AIV。截至目前，H5N8亚型AIV已扩散至大部分的欧洲、北美洲、中东和非洲国家，在全球范围内引起大流行，危害严重。尽管尚无报道人感染H5N8亚型AIV，但是其分布的广泛并且与其他亚型禽流感病毒流行株间的重组现象严重，对公共卫生安全造成了严重威胁。因此建立能迅速、有效的鉴别H5和N8亚型禽流感病毒的检测方法对于禽流感的防控及保证人类健康的安全具有重要意义

目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。纳米技术是20世纪80年代后期诞生并发展起来的一个新兴、高科技领域，是利用纳米科学知识研究纳米尺度物质的特性和相互作用，以及利用这些特性和现象的多学科的科学和技术。将纳米材料应用于聚合酶链式反应(PCR)中，即形成了纳米PCR(nano-PCR)技术，此技术可以很好地改善PCR反应的特异性、敏感性和反应效能等诸多方面，从而提高PCR检测结果的准确性、可靠性。2005年，中国科学院应用物理所和上海交通大学首次报道了纳米金粒子对PCR反应的优化作用，在纳米PCR反应液中加入尺寸小于100nm的纳米金粒子，将均相体系中的PCR技术扩展到纳米粒子表面，纳米金粒子能够提高酶的活性和稳定性，在较宽温度范围内产生类似单链结合蛋白(SSB)的效果，显著改善了非特异性扩增，提高了PCR的特异性。随着纳米PCR技术的发展，人们不断地进行改良和优化。目前，纳米PCR技术检测动物病毒已经有报道，而双重纳米PCR(nano-dPCR)技术反应同时扩增H5和N8基因来检测和鉴别H5N8亚型AIV的核酸检测技术尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供H5和N8亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。