[发明专利]Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法在审

专利信息
申请号: 202010378949.0 申请日: 2020-05-07
公开(公告)号: CN111471714A 公开(公告)日: 2020-07-31
发明(设计)人: 马三垣;常珈菘;夏庆友 申请(专利权)人: 西南大学
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;C12N5/10
代理公司: 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 代理人: 赵荣之
地址: 400715*** 国省代码: 重庆;50
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摘要:
搜索关键词: minos 座子 系统 生物 转基因 细胞系 构建 方法
【权利要求书】:

1.Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系的构建方法,其特征在于,具体步骤如下:

(1)合成Minos转座子系统基础载体PUC57-Mi-puro,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

(2)将外源基因连接至PUC57-Mi-puro,构建得到转基因载体;

(3)将步骤(2)的转基因载体与Mino转座酶的表达载体混合后转染真核生物细胞,筛选,即得所述细胞系。

2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,PUC57-Mi-puro包含Minos转座子的末端反向重复序列和标记基因表达框。

3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述标记基因包括但不限于puromycin抗性筛选基因、Zeocin抗性筛选基因、Blast抗性筛选基因等药物抗性筛选基因,红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等荧光蛋白标记基因。

4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,PUC57-Mi-puro包含:

Minos转座子的末端反向重复序列(inverted terminal repeat,ITR),其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;

puromycin抗性筛选基因表达框(Hsp70-puro-SV40),其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;

用于表达外源基因的框架,其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;

IE2启动子-家蚕丝胶1终止信号Ser1PA,其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,所述外源基因包括但不限于蛋白编码基因,ncRNA表达基因,miRNA表达框,sgRNA表达框。

6.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,将外源基因的核苷酸序列按照5’到3’方向连接到Minos转座子系统基础载体PUC57-Mi-puro的多克隆位点,多克隆位点限制性酶切位点包括AgeI、AsiSI、BglII和KpnI,构建成Minos转基因载体。

7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,采用酶切连接的方法将外源基因连接至PUC57-Mi-puro。

8.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中,所述Mino转座酶的表达载体为Minos-Helper,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

9.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中,转基因载体与Mino转座酶的表达载体按照摩尔比1:1进行混合。

10.利用权利要求1~9中任一项所述方法构建得到的Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系。

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