[发明专利]Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法

说明书

本发明涉及一种Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法，首先设计并合成了包含Minos转座子的末端反向重复序列和标记基因表达框的Minos基础载体，命名为PUC57‑Mi‑puro；然后将外源基因表达序列用酶切连接的方式连接到Minos基础载体上，构建成转基因过表达载体；再将转基因过表达载体和Minos transposase表达载体Minos‑Helper混合后转染真核生物细胞，筛选获得真核生物转基因细胞系。本发明提供的转基因细胞系构建方法简单，成本低，周期短，能够广泛的用于真核生物转基因细胞系的构建。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法。

背景技术

随着越来越多的生物完成了全基因组测序，生命科学研究步入了后基因组时代，功能基因组研究成为重中之重。遗传操作技术是研究功能基因组的重要技术手段，对于解析基因功能，探索生命奥妙至关重要。转基因技术是重要的遗传操作手段，转基因是指将人工分离和修饰过的基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。主要是通过人为操作，实现基因跨个体甚至跨物种转移，在基础研究和生物工程领域都有广阔的应用前景。在基础科研领域，运用转基因技术，可以对特定功能基因在特定物种中快速过表达，从而研究该基因的功能。在生产上，跨物种表达的转基因抗虫作物，转基因抗除草剂作物等广泛种植，对解决人类温饱问题做出了巨大的贡献。

目前广泛应用的转基因递送系统主要有广泛应用于哺乳动物的慢病毒、腺病毒系统；广泛应用于植物的农杆菌介导的T-DNA插入法、原生质体融合、花粉管通道法；广泛应用于昆虫、不如动物的转座子介导的转基因方法等。其中转座子系统介导的转基因方法因其简单、高效、安全而被广泛应用。

Minos转座子系统是从果蝇D.hydei中得到的Ⅱ型转座子，在宿主细胞中按照剪切和粘贴模式实现转座，安全高效。此外，Minos转座子在基因组上的插入位点特征是TA碱基，主要是分布在编码基因的内含子区域，能够最大限度的减少插入位点对内源基因的影响，是合适的真核生物转基因系统。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系的构建方法，具体步骤如下：

(1)合成Minos转座子系统基础载体PUC57-Mi-puro，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将外源基因连接至PUC57-Mi-puro，构建得到转基因载体；

(3)将步骤(2)的转基因载体与Mino转座酶的表达载体混合后转染真核生物细胞，筛选，即得所述细胞系。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，PUC57-Mi-puro包含Minos转座子的末端反向重复序列(inverted terminal repeat,ITR)和标记基因表达框。

作为进一步优选的技术方案之一，所述标记基因包括但不限于puromycin抗性筛选基因、Zeocin抗性筛选基因、Blast抗性筛选基因等药物抗性筛选基因，红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等荧光蛋白标记基因。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，PUC57-Mi-puro包含：

Minos转座子的末端反向重复序列(inverted terminal repeat,ITR)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

puromycin抗性筛选基因表达框(Hsp70-puro-SV40)，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；