[发明专利]一种快速鉴定水稻GAT植株的多重PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明提供一种快速鉴定水稻GAT植株的多重PCR检测试剂盒及应用，所述水稻GAT植株是指含有GAT载体的水稻，所述GAT载体含有雄性育性恢复基因表达盒、花粉败育基因表达盒、抗除草剂基因表达盒、除草剂敏感基因表达盒，和/或荧光基因表达盒。本发明提供的特异性引物组合能够快速检测待测样品中是否含有GAT载体上的花粉败育基因表达盒、抗除草剂基因表达盒、除草剂敏感基因表达盒，和/或荧光基因表达盒，检测方法特异性强，灵敏度高，且同时能用于检测各表达盒的表达量及拷贝数，为转基因安全检测提供了有效保障。

技术领域

本发明属基因工程领域，具体涉及一种快速鉴定水稻GAT植株的多重PCR检测试剂盒及其在检测GAT系统中花粉败育基因表达盒、抗除草剂基因表达盒、除草剂敏感基因表达盒和荧光基因表达盒中的应用。

背景技术

水稻是我国最重要的口粮作物，在保证我国粮食安全方面具有重要意义。杂交水稻利用水稻的杂种优势提高了水稻品种的产量、抗性、适应性等综合性状，使我国的水稻单产提高了15％-20％，为保障国家粮食安全作出了重要贡献。自从上世纪70年代杂交水稻推广应用以来，杂交水稻育制种技术已经经历了数代的发展(袁隆平.第三代杂交水稻初步研究成功.科学通报,2016,61(31):3404.)。

第一代杂交水稻育制种技术于70年代开发利用,需要用到不育系、保持系和恢复系等三种材料，因此也被称为“三系法”。用“三系法”进行杂交水稻种子生产时，首先用保持系和不育系杂交生产不育系，再用恢复系与不育系杂交生产杂交种。保持系自交可以繁殖保持系。三系不育系的雄性不育是由细胞核与细胞质的基因互作造成，只有细胞核含有特定恢复基因的恢复系与不育系杂交后才能恢复杂交后代的育性以生产杂交水稻，不具有恢复基因的品种与不育系杂交后将导致杂交后代不育从而导致绝收。只有约5％品种资源能够作为三系不育系的恢复系，种质资源利用率低。

第二代杂交水稻育制种技术始于80年代,需要用到不育系和恢复系，因此也被称为“两系法”。两系不育系的育性受到细胞核基因和光温环境的共同调控。一般其在特定光温条件下可以自交繁殖，否则保持不育，可以用来与恢复系杂交生产杂交种。两系不育系虽然可以“一系两用”，但其育性转换受到光温环境的影响，制种时易因光温环境而改变导致失败。

2006年，美国杜邦先锋公司率先在玉米中实现了基于隐性核雄性不育材料的杂交种子生产。该技术的基本原理是将育性恢复基因、花粉败育基因和筛选标记基因紧密连锁地导入隐性核雄性不育突变体中，获得核雄性不育突变体的保持材料，用于制种和育种(Albertsen MC,Fox TW,Hershey HP,et al.Nucleotide sequences mediating plantmale fertility and method of using same.Patent No.WO2007002267,2006.)。隐性核雄性不育系的育性仅由一对隐性核基因控制，因此其育性不受光温环境影响，并且任何品种都可以作为其恢复系与其杂交产生可育后代。该技术不但能最大限度的利用品种资源选育出高产、优质、多抗品种，还能不受光温环境的影响实现杂交种的高纯度稳定繁制,因此,从根本上解决了第一代和第二代杂交水稻育制种技术的问题，被誉为第三代杂交育制种技术(袁隆平.杂交水稻发展的战略.杂交水稻,2018,33(5):1–2.)。

为了实现利用水稻隐性核雄性不育系进行育制种，我们研发了属于第三代水稻杂交育制技术的遗传智能技术(Genetic Automation Technology，GAT)。我们构建了GAT载体，将植物雄性育性恢复基因表达盒、植物花粉败育基因表达盒，抗除草剂基因表达盒，除草剂敏感基因表达盒，荧光基因表达盒构建到GAT载体上并转化到不育突变体中创制GAT保持系。为了加强对GAT保持系的筛选和监管，开发出一种适合GAT植株的快速、高效、特异的多重PCR检测试剂盒非常有必要。

发明内容