[发明专利]家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法

权利要求书

1.家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除载体，命名为pB-CRISPR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其作为骨架载体；

(2)设计敲除家蚕全部基因的sgRNA，其核苷酸序列是位于基因区符合NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG特征的序列；

(3)将步骤(2)的sgRNA整合到步骤(1)的骨架载体上，构建得到所述载体文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，载体pB-CRISPR包括Hr3CQ Enhancer-Hsp70启动子启动的spCas9蛋白编码序列，IE2启动子启动的Zeocin抗性蛋白编码序列，U6启动子启动的sgRNA表达框和piggyBac转座子的转座臂。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：

(1-1)合成包含Zeocin抗性基因表达框的载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA；

(1-2)将载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA上的Zeocin抗性基因表达框IE2-Zeocin-Ser1PA表达框连接到piggyBac转座子基础载体piggyBacModify上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}；

(1-3)将hr3-hsp70-Cas9-sv40表达框从载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40上扩增出来，然后用无缝克隆的方法连接到pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}；

(1-4)将U6-gRNA从载体pUC57-U6-gRNA扩增出来，用酶切连接的方法连接到载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}的AscI/NheI位点，构建成真核生物基因敲除基础载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{U6-gRNA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，命名为pB-CRISPR；

其中，载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

piggyBac转座子基础载体piggyBacModify，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

载体pUC57-U6-gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，pB-CRISPR包含家蚕U6启动子和sgRNA的骨架，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，基于家蚕U6启动子在第一个核苷酸为鸟嘌呤核苷酸“G”时的启动效率最高，全部sgRNA序列的5’端添加一个鸟嘌呤核苷酸“G”。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：基于spCas9作用规律，设计家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点，每个基因设计约6个打靶位点，总计94000个。