[发明专利]家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法

说明书

本发明涉及家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法，包含用于递送CRISPR/Cas9系统的递送载体系统piggyBac转座子载体系统和家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点的sgRNA序列共同组成的载体文库pB‑CRISPR‑library。本发明基于piggyBac转座子系统的强大的承载容量，可以将CRISPR/Cas9系统的两个组成原件Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框整合到一个载体上，同时该载体还包含筛选标记Zeocin抗性基因表达框，共同组成了一个用于家蚕的CRISPR/Cas9敲除的all‑in‑one载体pB‑CRISPR。

技术领域

本发明属于真核生物基因敲除技术领域，涉及家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法。

背景技术

家蚕不仅是重要的经济昆虫，也是鳞翅目模式生物。家蚕是最早完成全基因组测序的生物之一，家蚕基因组计划完成后，家蚕功能基因组研究就成为了家蚕研究领域的重要方向，目前已经建立了转基因、RNAi、基因编辑等遗传操作技术用于研究家蚕功能基因，但是，面对数以万计的家蚕编码蛋白基因的功能，传统的正向遗传学耗时耗力，迫切需要一种高通量研究手段来研究数量巨大的家蚕功能基因。

高通量RNAi是最早用于研究真核生物功能基因的高通量研究方法(PMID:25145850)，已经在人、鼠等物种取得了很多研究成果，但是RNAi天然存在的脱靶效应、无法完全敲除基因功能而只能敲低功能基因的mRNA表达水平等缺点，其高通量筛选研究受到限制。CRISPR/Cas9系统是近年来开发出来的基因敲除技术，已经在包括人、鼠、果蝇、拟南芥、水稻等模式生物钟取得了显著成果，目前CRISPR/Cas9系统在家蚕中的应用也已经取得了成功。

CRISPR/Cas9系统是由两部分元件组成，用于执行核酸内切酶功能的Cas9蛋白和用于执行引导Cas9蛋白到打靶位点的功能的sgRNA。基于其设计和构建的简便性，CRISPR/Cas9系统不仅能够实现单个基因的敲除，还可以非常方便地设计并构建用于全基因组敲除的sgRNA文库，从而实现全基因组编辑，目前，在真核生物中主要是运用慢病毒载体系统来递送CRISPR/Cas9全基因组敲除文库。但是，慢病毒系统有着固有的缺点，一、慢病毒载体承载容量有限，一般只能够携带几kbp的外源基因，而且随着插入片段长度增加病毒滴度急剧降低，因此，慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因敲除系统一般是先将Cas9表达框整合到宿主细胞的基因组上，然后再将sgRNA表达框整合到宿主细胞的基因组上，增加了构建CRISPR/Cas9基因敲除文库的周期、成本和难度；二、无法广泛应用于多种类型真核生物，主要应用在哺乳动物，慢病毒系统无法在昆虫等物种中递送CRISPR/Cas9敲除文库。

piggyBac转座子是最初发现于鳞翅目昆虫，是真核生物的第二类转座子，以“剪切-黏贴”的模式来实现转座。piggyBac系统的宿主范围广泛，从低昆虫哺乳动物均可实现高效转座，piggyBac转座子可以携带的外源基因片段极大，可达207kb。应用piggyBac系统可以将Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框构建到同一个piggyBac转座载体上，只需要一步转染就可以CRISPR系统整合到宿主细胞的基因组上，极大缩短实验周期，降低实验成本和操作难度。由于piggyBac转座子是以“剪切-黏贴”的方式来实现来实现转座，因此可以通过控制转座子浓度等方式来控制piggyBac转座子系统携带的外源基因整合到宿主细胞的拷贝数。

在家蚕中还没有任何高通量研究功能基因组的技术手段，构建家蚕基于piggyBac系统和CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除的载体文库非常必要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库的构建方法，具体步骤如下：