[发明专利]一种基于病原菌线粒体基因组序列检测西瓜枯萎病、番茄枯萎病和莲藕腐败病病原的方法

说明书

本发明公开了一种通过线粒体基因组差异序列快速鉴定(或区分)Fusarium commune和Fusarium oxysporum菌株的方法。本发明还公开了利用上述差异序列接合环介导等温扩增(Loop‑mediated isothermal amplification，缩写为LAMP)技术可以在活体植株的维管束渗出液或活体材料上直接进行检测，免除了核酸提取过程的繁琐步骤。接合植株的发病症状，本发明可以快速确诊西瓜枯萎病、番茄枯萎病和莲藕腐败病的病原，可用于相关作物病害的预测预报，为相关病害的防控赢得宝贵时间，减少病害发生造成的损失。

技术领域

本发明采用基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，缩写为PCR)和环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，缩写为LAMP)技术快速检测西瓜枯萎病、番茄枯萎病和莲藕腐败病病原菌的方法，属于生物技术研究领域。

技术背景

莲藕腐败病又称为藕瘟病，是莲藕种植过程中的重要病害之一，藕田发病后减产10～20％，严重的可达60％～80％。在1983年，该病最初报道由真菌尖刀镰孢菌莲专化型【Fusarium oxysporum Schl.f.sp.Nelumbicola(Nis.Wat.)Booth】侵染引起，但近些年国内同行的相关研究表明，另一种镰刀菌属的病原真菌F.commune，同样可以侵染莲藕并且导致莲藕腐败病的相似症状。有报道，F.commune和F.oxysporum侵染植物的机理基本相似，都通过菌丝体及厚垣孢子随病残体在藕田土壤中越冬，在条件合适的时候，从地下茎或根系侵入，然后在茎内和整个植株内蔓延，导致茎节及根系变色腐烂，地上部叶片、叶柄以及莲蓬枯死。

在遗传学方面，F.commune和F.oxysporum非常相近，它们基因组当中的内转录间隔区(internal transcribed spacer，缩写为ITS)一致性为100％，无法对其进行区分；在形态学方面，它们互为姐妹菌株，如果不是从事真菌分类和鉴定的人员很难快速而准确地区分它们。目前，常用的区分手段就是对其看家基因(例如：mtSSU，EF1α等)的保守序列进行PCR扩增，完成Sanger法测序后，将序列比对后实现病原菌的鉴定。但这种方法步骤多，从真菌样本的准备，提取基因组到最后测序完成，需要至少等待3天以上的时间，样本量增多之后容易出错，消耗的试剂成本也不低。

在陆地种植的西瓜和番茄也同样受到镰刀菌属病原物的威胁，其中最主要的就是西瓜枯萎病和番茄枯萎病这两种土传病害。造成西瓜枯萎病的病原物主要有三种尖孢镰刀菌专化型引起，分别是F.oxysporum f.sp.niveum，F.oxysporum f.sp.cucumerinum和F.oxysporum f.sp.radicis-cucumerinum；导致番茄枯萎病的病原物则主要是F.oxysporum f.sp.lycopersici和F.oxysporum f.sp.radicis-lycopersici。

上述病菌都属于土传病原真菌，在侵染初期症状不明显。因此，建立一种快速而准确的方法用来评估种苗以及在发病初期(或尚未显症时期)的植株当中是否存在上述的病原物就显得非常重要。依据上述评估和检测结果，植保人员和农户可以及时地进行病害防控等补救措施，并对后续的田间管理以及病害防治提供依据和预案。