[发明专利]治疗自身免疫性相关疾病的病毒载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种病毒载体在制备治疗自身免疫相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述病毒载体为克隆有mfat-1基因的慢病毒表达质粒或克隆有mfat-1基因的腺相关病毒表达质粒，所述的mfat-1基因如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的慢病毒表达质粒为pLJM1-CMV-hPGK-EGFP质粒、pLJM1-CMV-hPGK-mkate2质粒、pLenti-CMV-MCS-GFP-SV-puro质粒、FUGW、pLenti-puro、pLenti-MP2或pLenti质粒；所述的腺相关病毒表达质粒为pEMBL-AAV-D(+)-CMV-eGFP-SV40质粒、AAV GFP质粒、AAV1质粒、AAV2质粒、rAAV2质粒、AAV5质粒、AAV8质粒、AAV9质粒或pAV-FH AAV质粒。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，还包括构建的病毒载体的方法：将所述mfat-1基因克隆至慢病毒表达质粒或腺相关病毒表达质粒，即得。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)以所述mfat-1基因序列为模板，设计如下引物进行PCR扩增，使获得的所述mfat-1基因序列两端带有NheI和EcoRI酶切位点，所述引物如下：

mfat-1-F：5'-TATTAAGCTAGCATGGTCGCCCACAGCA-3'；

mfat-1-R：5'-CAACCGGAATTCTCATCACTTGGCCT-3'；

(2)将步骤(1)获得的PCR扩增产物进行电泳，然后切胶回收、纯化，将所得PCR扩增产物进行用限制性内切酶NheI和EcoR酶切，备用；取空载的所述慢病毒表达质粒或腺相关病毒表达质粒使用限制性内切酶NheI和EcoR酶切，备用；

(3)将步骤(2)获得的DNA片段连接在酶切后所述空载穿梭质粒上，即得。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR扩增反应体系包括：Buffer(Mg2+plus)，10μl；

dNTP Mixture，各dNTP 2.5mM，4μl；

模板DNA，20-200ng；

上游引物mfat-1-F，10μM，1μl；

下游引物mfat-1-R，10μM，1μl；

HSDNA Polymerase，2.5U/μl，0.5μl；

补灭菌超纯水至50μL。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR扩增反应程序为：98℃变性5min；98℃10s，60℃15s，72℃2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述病毒载体能矫正Th细胞分化失衡和炎症，促进胰岛beta-细胞新生，恢复胰岛功能以治疗1型糖尿病。

8.一种病毒颗粒在制备治疗自身免疫相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述病毒颗粒为将权利要求1或2中所述的病毒载体转化至细胞中后得到的病毒颗粒。

9.根据权利要求1-8任一项所述的应用，其中所述自身免疫相关疾病为系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎或1型糖尿病。

10.一种治疗自身免疫相关疾病的药物，其特征在于，包括权利要求1或2中所述的病毒载体或权利要求7中所述的病毒颗粒，以及其药物可接受的载体。

11.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，包括将权利要求1或2中所述的病毒载体或权利要求7中所述的病毒颗粒按照常规工艺，添加常规辅料制备成临床上可接受的剂型。

12.根据权利要求10或11所述的药物，其中所述自身免疫相关疾病为为系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎或1型糖尿病。