[发明专利]一种生产依博素的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种生产依博素的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明所提供的制备用于生产依博素的工程菌的方法，包括如下步骤：降低链霉菌139中Ste2蛋白的表达量和/或活性，获得用于生产依博素的工程菌。采用本发明制备的工程菌生产依博素，产量达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。本发明具有重大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产依博素的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

依博素是从链霉菌139(Streptomycessp139)中分离得到的一种具有抗白细胞介素1受体(IL-1R)活性的微生物多糖，其由鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖和半乳糖醛酸8种单糖组成的重复单元序列聚合而成，结构式见式(Ⅰ)。药效学研究结果显示，依博素具有抑制急性、慢性增生性炎症和Ⅳ型迟发型超敏反应的作用，并对化学性物质诱发的疼痛及佐剂型关节炎疼痛具有镇痛作用；同时依博素可以显著抑制II型胶原类风湿性关节炎动物模型IL-1β和TNFα的表达和分泌，对炎症滑膜细胞(CIA-FLS)及人急性白血病单核细胞(THP-1)的炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的生成有显著抑制作用。

依博素重均分子量(Mw)为50.0×10⁴－70.0×10⁴，是我国最早从链霉菌中发现的、口服安全性好并可能应用于医药领域的新型胞外多糖。经动物实验后初步判断在人体内口服用量约为1200mg/天，体内用量相对较大。通过基因工程手段对依博素产生菌进行基因改造，在不改变其药效的前提下，提高其单位发酵产量，能够极大的节约企业生产成本，有利于进一步开发。

编码糖基转移酶的基因和编码糖核苷酸前体基因是微生物多糖生物合成的关键基因。研究表明，参与依博素生物合成的基因簇中，ste5基因编码双功能引导糖基转移酶(双功能引导糖基转移酶能够特异催化UDP-半乳糖和葡萄糖到脂质受体)，ste7基因编码岩藻糖糖基转移酶，ste15基因编码葡萄糖糖基转移酶，ste22基因编码鼠李糖糖基转移酶，ste17基因编码葡萄糖-1-磷酸胞嘧啶转移酶，ste6基因编码UDP-葡萄糖脱氢酶，ste19基因编码UDP-半乳糖-4-差向异构酶。然而调控上述酶的表达量只能不同程度的影响依博素的结构及生物活性，并不影响依博素的产量。

发明内容

本发明的目的是提高依博素产量。

本发明首先保护一种制备用于生产依博素的工程菌的方法，包括如下步骤：降低受体菌中Ste2蛋白的表达量和/或活性，获得用于生产依博素的工程菌；

所述受体菌为能够生产依博素的菌。

上述方法中，所述Ste2蛋白可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的来源于链霉菌139且与Ste2蛋白具有相同功能的蛋白质；

a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，来源于链霉菌139且与Ste2蛋白具有相同功能的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：2由425个氨基酸残基组成。

为了使Ste2蛋白便于纯化和检测，可在由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的Ste2蛋白的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列