[发明专利]一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒，所述的试剂盒包含分别与各检测基因对应的多个叠瓦式寡核苷酸探针，用于获取所述检测基因的热点突变区域的变异信息；所述检测基因包括48个检测基因。本发明还公开了采用免疫磁珠分选细胞结合高通量测序技术检测能提高多发性骨髓瘤基因突变的检出率，可有效避免在多发性骨髓瘤中低频比例的基因突变漏检情况，在多发性骨髓瘤的诊断、治疗以及微小残留病灶(MRD)监测应用中具有广泛的临床价值。

技术领域

本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒和检测方法。

背景技术

目前已知的血液肿瘤就包括了40多种白血病、50多种淋巴瘤和多种骨髓瘤。多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生的恶性肿瘤，是一种目前还无法治愈的血液恶性肿瘤。多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞克隆增殖性疾病，正常的浆细胞负责生成对抗感染的抗体(免疫球蛋白)，骨髓中发生癌变的浆细胞称为骨髓瘤细胞，它在骨髓中大量增殖聚集，替代了骨髓中正常的细胞，破坏正常的免疫系统，并抑制正常的造血功能，进一步损伤骨骼及软组织(神经和肌肉等)等的功能。多发性骨髓瘤在全球发病率各不相同，在美国，多发性骨髓瘤是继非霍奇金淋巴瘤的血液系统第二大恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的1％，占血液系统恶性肿瘤的13％。在中国，多发性骨髓瘤发病率约为1/10万～2/10万，已经超过急性白血病，位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。

随着对多发性骨髓瘤发病机制研究的不断深入、诊断标准和预后评估方式的更新、新药的不断问世，以及异基因造血干细胞移植供者来源问题的解决，MM患者的治疗效果已经明显得到改善。近几年来，国内多发性骨髓瘤诊疗水平也取得了长足进步，逐渐与国际水平接轨。NCCN、ESMO、中国多发性骨髓瘤诊治指南中明确指出关于多发性骨髓瘤的诊断分型、鉴别诊断、治疗及复发治疗。数据库中权威文献报道与多发性骨髓瘤相关基因突变的预后影响，其中包括预后良好的基因(IRF4、EGR1等)突变，预后不良的基因(TP53、ATM、ATR、ZFHX4等)突变，这些基因的变异情况均可作为MM患者预后分子标记物。

高通量测序技术(NGS)出现以来，血液肿瘤受相关基因突变影响尤为明显。最常见的基因涉及MAPK通路、NF-kB通路、DNA损伤应答/TP53通路。迄今为止的实验证据表明，多发性骨髓瘤的进展，无论是无症状期的自发进展还是治疗后的复发，都与其异质性克隆及亚克隆成分有关。新发的多发性骨髓瘤(MM)突变谱具有高度异质性，只有少数基因突变在多发性骨髓瘤患者中反复出现，而10％的患者中同时存在多个的基因突变，在同一患者中，基因突变通常只存在于一小部分细胞中，因此，我们需要将这一小部分细胞先富集纯化做预处理，再从预处理后的细胞中提取核酸进行高通量测序。这样，预处理和复发多发性骨髓瘤患者样本中，亚克隆结构的基因突变检测频率更高。

目前，我们仍然主要依靠形态学特征和有限的免疫表型来识别克隆浆细胞，浆细胞疾病的范围从无症状的浆细胞单克隆群到浆细胞白血病和多发性骨髓瘤，其中骨髓中的正常细胞可以被骨髓瘤浆细胞积累所取代。免疫磁珠分选细胞已成为一种宝贵的工具，根据多发性骨髓瘤患者CD138+的强表达，浆细胞可以从其他白细胞中分离出来。本发明中涉及了采用免疫磁珠分选法从新鲜或冷冻的人骨髓单核细胞中分离高纯度CD138+细胞，通过识别CD138表面标记物的抗体靶向CD138+细胞进行阳性选择，相比流式细胞仪分选的复杂操作，此方法具有温和、快速简单、高纯度的优势。

基于富集CD138+细胞的基础上，对富集后CD138+细胞进行核酸提取，设计一系列的叠瓦式寡核苷酸探针，探针覆盖区域为与多发性骨髓瘤相关的48种基因编码区，通过探针与基因组DNA片段进行杂交实现对特定基因组区域的富集，随后通过NGS技术对该区域进行深度测序，发现目标区域的特定变异信息。鉴于市场上与多发性骨髓瘤相关基因检测大多是对全血细胞中提取的核酸DNA进行高通量深度测序，由于多发性骨髓瘤基因突变通常只存在于一小部分细胞中，我们需要将这一小部分细胞先富集，可以避免在多发性骨髓瘤中漏检基因变异的情况。