[发明专利]基于FRET的PSA荧光探针、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了基于FRET的PSA荧光探针、制备方法及应用，属于法医检验技术领域。首先基于荧光共振能量转移机理设计，合成了靶向识别检测前列腺特异性抗原的有机小分子荧光探针，通过质谱、高效液相色谱法等对探针进行结构及纯度表征分析，采用荧光光谱法测试探针对前列腺特异性抗原的荧光响应，通过对不同附着物的精液样品检材，利用倒置荧光显微镜观察记录荧光成像。荧光光谱实验表明其对前列腺特异性抗原有较好响应，最低检测限为0.8μg/mL，不同附着物精液检材荧光成像实验进一步验证了荧光探针在精液斑确证试验上的应用，有望用于法医学领域精液斑的确证试验。

技术领域

本发明涉及基于FRET的PSA荧光探针、制备方法及其应用，属于法医检验技术领域。

背景技术

前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)是由前列腺腺泡和导管的上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白，参与精液的液化过程。前列腺特异性抗原具有极高器官特异性和种属特异性，被用于法医物证学精斑确证试验，是可以替代精子显微镜检查的最常用的确证方法，特别适用于无精症精液斑鉴定。临床常规用于前列腺良性与恶性疾病鉴别诊断，以及前列腺癌患者术后随访的重要指标。

前列腺特异性抗原的检测方法通常包括酶联免疫吸附法、表面等离子共振、电化学发光、电化学免疫分析、胶体金法和荧光法等，但部分检测方法存在成本高、检测条件苛刻等局限性而限制了其实际应用。

利用靶向肽序列识别检测特定蛋白质具有低成本、易合成、稳定性好、安全可靠和适应性好等优点逐渐地被开发和应用。有机小分子荧光探针能够特异性检测某些标志物，在检测方面正在发挥着重要作用。已有数篇文献报道利用PSA对特定肽序列(HSSKLQ)具有识别水解特性，设计基于靶向肽序列的不同荧光探针对PSA进行特异性检测。

James Gooch等先后基于该肽序列HSSKLQ分别与荧光基团香豆素、罗丹明连接，制备出有机小分子荧光探针，验证了探针对PSA的特异性识别作用，且不影响PSA性质，可回收检材用于DNA分析，降低假阴性出现概率。

党福全课题组基于该序列制备的金纳米荧光探针，选择性实验表明，Mb,THF,LYZ,GOD,β-LAG,BSA等容易造成实验假阳性的蛋白不能使肽序列HSSKLQ裂解。

发明内容

本发明基于荧光共振能量转移机理(FRET)，将荧光基团与淬灭基团通过特定肽序列连接，制备一种前列腺特异性抗原荧光探针(DabcylGGHSSKLQLAAAK-FAM)，实现对前列腺特异性抗原的识别检测。

本发明第一个目的，提供一种新型荧光探针，所述荧光探针具体结构如下：

本发明第二个目的，提供上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：第一步为直线肽固相合成：{Dabcyl}-GGHSSKLQLAAAK(5-FAM)，第二步为多肽树脂的裂解，第三步为分离纯化，第四步为分析检测。

进一步地，在上述技术方案中，所述第一步直线肽固相合成操作为，用Fmoc-Lys(5-FAM)-Wang Resin S＝0.3mmol/g，采用Fmoc/Tbu合成策略工艺，从C端向N端(从右到左)依次缩合氨基酸链接，待直线肽缩合完成多肽树脂。

依次偶联下列氨基酸及原料：A-02Fmoc-Ala-OH,A-03Fmoc-Ala-OH,A-04Fmoc-Ala-OH A-05Fmoc-Leu-OH,A-06Fmoc-Gln(Trt)-OH,A-07Fmoc-Leu-OH,A-08Fmoc-Lys(Boc)-OH,A-09Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-10Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-11Fmoc-His(Trt)-OH,A-12Fmoc-Gly-OH,A-13Fmoc-Gly-OH,A-14Dabcyl acid将肽树脂洗涤转移出干燥至恒重，待裂解。