[发明专利]一种具有多等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法

权利要求书

1.一种具有多等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，该方法包括有如下步骤：

采用寡核苷酸的第一DNA接头修饰pUC18质粒的SacI位点，使SacI位点转换为SpeI位点，生成质粒pUC18_SpeI242；

从含有p53基因的穿梭质粒pSTL-p53中纯化含有p53表达盒的SpeI-SalI片段；

将SpeI-SalI片段克隆至质粒pUC18_SpeI242中，生成质粒pSpeI-SalI_p53；

采用寡核苷酸的第二DNA接头修饰质粒pSpeI-SalI_p53的KpnI位点，使SacI位点转换为NheI位点，生成质粒pSSp53KN，采用第一DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位点之间，生成质粒pSSp53KN(1)

采用寡核苷酸的第三DNA接头修饰质粒pSpeI-SalI_p53的XmaI位点，使XmaI位点转换为NheI位点，生成质粒pSSp53XN；采用第二DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位点之间，生成质粒pSSp53KN(2)；

将质粒pSSp53XN(1)与质粒pSSp53KN(2)进行匹配产生具有p53等位基因双拷贝的中间质粒pUC_TDMp53(1+2)；

将中间质粒pUC_TDMp53(1+2)中的SpeI-SalI片段导入至穿梭质粒pSTL-p53中，获得p53等位基因双拷贝的穿梭质粒pSTL-TDMp53(1+2)；

将穿梭质粒pSTL-TDMp53(1+2)采用Pme1酶切使之线性化，然后和伙伴pAdEasy质粒一起通过电穿孔导入进宿主细菌，通过宿主细菌的细胞内进行同源重组，提取其含有p53编码序列等位基因双拷贝的表达盒和腺病毒骨架的质粒，然后通过电穿孔手段导入HEK-293细胞，产生具有p53编码序列等位基因双拷贝的重组腺病毒。

2.根据权利要求1所述的具有多等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，

第一DNA片段和第二DNA片段分别包括可互补结合的通用对片段和可变对片段，其中的通用对片段的双链序列如下：

5’AGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAG 3’

3’TCCAGGTCTACTTCGAGGGTCTTACGGTCTCCGACGAGG 5’

其中的可变对片段的双链序列如下：

5’GCTGCTCCC NNN GTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACA 3’

3’G MMM CACCGGGGACGTGGTCGTCGAGGATGTGGC C5’

其中，NNN表示一个可变密码子，MMM表示与NNN互补配对的反密码子。

3.根据权利要求2所述的具有p53编码序列等位基因双拷贝的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，

第一DNA片段和第二DNA片段中的可变密码子NNN为表达不相同的氨基酸的不相同的密码子。

4.根据权利要求2所述的具有多等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，

可变密码子为如下密码子中的任一种：

CCT,CCA,CCG,CGT,CGA,CGG,AGA,AGG,CTT,CTA,CTG,TTA,TTG,GCC,GCT,GCA,GCG,TGC,TGT,GAT,GAC,GAG,GAA,TTC,TTT,GGG,GGA,GGC,GGT,CAC,CAT,ATC,ATT,ATA,AAG,AAA,ATG,AAC,AAT,CAG,CAA,TCC,TCT,TCA,TCG,AGT,AGC,ACC,ACT,ACA,ACG,GTG,GTT,GTC,GTA,TGG,TAC,TAT，CCC，CGC和CTC。

5.根据权利要求1所述的具有多等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，

第一DNA接头的双链序列是：

5’AGCTGACTAGTC3’

3’CTGATCAGTCGA5’。