[发明专利]一种具有多等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法

说明书

一种具有多等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法，包括有如下步骤：采用寡核苷酸的第一DNA接头修饰pUC18质粒，并将含有p53表达盒的片段克隆至修饰后质粒中，然后分别采用第二DNA接头及第三DNA接头修饰后得到的两种质粒进行匹配产生具有p53等位基因双拷贝的中间质粒，将中间质粒中的SpeI‑SalI片段导入至穿梭质粒中，获得p53等位基因双拷贝的穿梭质粒将穿梭质粒pSTL‑TDMp53(1+2)采用Pme1酶切使之线性化，然后和伙伴pAdEasy质粒一起通过电穿孔导入进宿主细菌，通过宿主细菌的细胞内进行同源重组，提取其含有p53编码序列等位基因双拷贝的表达盒和腺病毒骨架的质粒，然后通过电穿孔手段导入HEK‑293细胞，产生具有p53编码序列等位基因双拷贝的重组腺病毒。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及到一种具有至少双等位基因p53编码序列的重组腺病毒的制备方法。同一载体中p53等位基因的组合可能更有助于改善针对不同瘤种的治疗效果，使其具有组织特异性，瘤种特异性乃至患者特异性。

背景技术

p53基因是一种肿瘤抑制基因，已被广泛作为各瘤种的互补或增强治疗手段所采用，通常与化疗、放疗、免疫治疗以及其他广泛认可的疗法联用。当p53基因进入肿瘤时，基因表达为mRNA，进而翻译为功能性蛋白。该蛋白产物预测大小为43.7kDa，但因其在凝胶电泳中出现在53kDa处，因此得名p53，这一现象是因为氨基酸残基构成中有相对较多的脯氨酸残基所致，同时，大规模的翻译后修饰对于蛋白功能的表现也是必不可少的。

p53基因编码P53蛋白，它的全长表型由393个氨基酸残基组成。也存在其它较短的p53表型，主要来源于mRNA产物的选择性剪接。

深圳市赛百诺基因技术有限公司自主研制开发的基因治疗产品“重组人p53腺病毒注射液”(今又生，Gendicine)是世界上首个被批准上市的基因治疗药物，其本质是利用腺病毒和人p53基因拼装得到的重组腺病毒。

人的P53蛋白可对高危癌前病变的DNA损伤进行修复，对DNA损伤无法修复的细胞，P53蛋白则诱导其进入冬眠状态或细胞凋亡。

“Gendicine”的载体采用第一代人5型腺病毒，其基因不整合到宿主细胞基因组中，无遗传毒性；载体经基因工程改造后，只对细胞实施一次感染，不能复制，无环境污染。

Gendicine的疗效因肿瘤类型的不同而异，同样的肿瘤类型患者之间也存在差异。这种现象被认为是由于不同癌症类型中表达的基因组的组织特异性差异造成的，它们反过来又受到个体基因组成的影响，并进一步受到可能导致恶性肿瘤的环境因素的调节。

因此，对治疗的反应，包括对Gendicine的反应，可能因病例而异，我们寻求Gendicine其中携带的p53基因的最佳化学结构，以解决肿瘤细胞对其他细胞毒性效应的不良或有限反应。

发明内容

经过研究发现，p53基因的这种最佳化学结构有可以通过改变特定位置的氨基酸残基和观察其对生物活性的影响来确定。

在肿瘤抑制的p53基因中，其72号密码子存在一种常见的多态性，其编码的氨基酸残基要么是脯氨酸(Pro,P)，要么是精氨酸(Arg,R)，极少情况下也可以是亮氨酸 (Leu,L)，这些为存在人体中的野生型p53基因。

72号密码子编码氨基酸残基被其它残基替代时形成的变体型p53基因，可以使变体型p53基因的某些功能显著增强，一个特定的氨基酸残基替代就能显著改善有利的 p53功能，从而提高Gendicine在癌症治疗中的疗效。

突变研究表明野生型p53的脯氨酸富集结构域(PRD)，也正好是72号密码子所在的区域，参与了细胞凋亡的有效诱导、致癌基因转化的抑制、转录激活、促成p53 与DNA结合等一系列功能。