[发明专利]一种采用连续过滤的外泌体质谱分析方法

说明书

本发明涉及一种采用连续过滤的外泌体质谱分析方法，包括(1)将待测液体整备后提取待测液体样本；(2)将所述待测液体样本经过一级过滤膜、二级过滤膜和三级过滤膜三层过滤，在三级过滤膜上获取外泌体样本；(3)直接取出所述三级过滤膜，使用由乙腈、三氟乙酸、去离子水和芥子酸制成的混合溶剂处理后，在所述三级过滤膜上进行质谱检测获得检测结果，本发明方法分析方便且稳定，检测时间小于1小时，与目前标准超速离心方法获得的外泌体囊胞分离纯化后质谱检测的图谱主要信号一致，本发明成本低、样本所需量少、快速方便、精准稳定，避免了超速离心技术等的耗时耗费资源等缺点，具有广泛的生物和医学运用前景。

技术领域

本发明涉及一种采用连续过滤的外泌体质谱分析方法，属于医学实验分析方法。

背景技术

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(Matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)自1980年代发展起来，具有超高灵敏度和特异性，MALDI-TOF MS技术通过对生物分子的分子量进行准确测定，实现生物大分子的鉴定分析；通过分析不同细菌的指纹图谱，MALDI-TOFMS能实现医学实验快速鉴定；此外，MALDI-TOF MS技术也广泛应用于蛋白质组学研究。

外泌体是胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EV，胞外囊泡尺寸约30-1000nm)的一种，其直径约为30-150nm，外泌体囊壁由磷脂双分子层组成，囊壁富含膜蛋白。外泌体囊泡内含有蛋白质、核酸(miRNA、mRNA等)、膜蛋白或脂质等物质。

超速离心是目前外泌体分离方法的“金标准”，但是超速离心技术分离纯化外泌体存在耗时、昂贵、样本量损耗大等缺点，过滤膜技术可以分离纯化外泌体，当样本量较大采用过滤膜分离纯化富集外泌体囊泡则容易堵住或阻塞的缺点，且外泌体经过过滤膜是否容易黏附无法洗脱的特点。

现有技术中，中国发明专利号为ZL2016105973232、名称为《人体体液中外泌体的提取方法》公开了“a、体液样本制备：首先在无菌条件下提取人体体液，并用PBS缓冲液进行稀释，然后通过离心筛选初步去除体液中的细胞成分和细胞碎片，制成体液样本备用；b、体液样本纯化：通过过滤膜对步骤a中的体液样本进行过滤，进一步去除体液中的细胞残片及其他杂质，静置10～15分钟，留取沉淀物备用；c、外泌体提取：将步骤b中所得的沉淀物用PBS缓冲液进行悬浮，使外泌体悬浮于液体上层，然后用无菌针管吸取上层含有外泌体的液体，置于-80℃储存备用”，虽然该专利公开了将体液样本通过过滤膜进行过滤提取，但是其过滤后用于质谱检测的结果准确度无法达到要求，其过滤及处理的方法也达不到要求，无法满足替代超速离心法来进行实验检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为克服上述问题，提供一种检测精度与超速离心相当，但成本低、时间短的采用连续过滤的外泌体质谱分析方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种采用连续过滤的外泌体质谱分析方法，包括以下步骤：

(1)将待测液体整备后提取待测液体样本；

(2)将所述待测液体样本经过一级过滤膜、二级过滤膜和三级过滤膜三层过滤，在三级过滤膜上获取外泌体样本；

(3)直接取出所述三级过滤膜，使用由乙腈、三氟乙酸、去离子水和芥子酸制成的混合溶剂处理后，在所述三级过滤膜上进行质谱检测获得检测结果。

优选地，所述一级过滤膜的孔径为1000nm，所述二级过滤膜的孔径为300-450nm，所述三级过滤膜的孔径为30-50nm。

优选地，所述一级过滤膜、二级过滤膜和三级过滤膜之间都设置有中空套管，所述中空套管的直径4-6mm，待测液体样本通过中空套管和三层过滤膜的过滤速度为50μl/min。