[发明专利]一种报告基因细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种报告基因细胞株及其构建方法和应用，所述报告基因细胞株的基因组中整合有嵌合基因，所述嵌合基因包括IFN‑β启动子和报告基因；所述报告基因为分泌性荧光素酶基因。本发明构建的报告基因细胞株可以将荧光素酶分泌到细胞外，为检测IFN通路激活提供了简易手段，为进一步研究病毒诱导IFN‑β的转录、调控，动态监测IFN‑β启动子活性奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种报告基因细胞株及其构建方法和应用，尤其涉及IFN-β启动子分泌性荧光素酶稳定表达细胞系及其构建方法和在检测IFN通路激活状态中的应用。

背景技术

先天性免疫是细胞抵御病毒感染的第一道防线，病毒感染细胞后，细胞的模式识别受体(RIG-I、TLR3、cGAS等)识别病毒的病原相关分子模式，通过接头蛋白(MAVS、STING等)、信号传递蛋白(TBK1、IKK等)、转录因子(NF-κB、IRF-3等)转录出促炎细胞因子和干扰素(IFN)，其中IFN通过自分泌或旁分泌途径与细胞表面IFN受体(IFNR)结合，激活下游JAK-STAT途径，促使大量干扰素刺激基因的表达，发挥抗病毒作用。IFN是一种分泌性的糖蛋白，家族成员分为三类，即I型、II型和III型IFN，其中I型干扰素IFN-β是机体重要的细胞因子，在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。IFN-β是通路激活的效应蛋白和指征蛋白，IFN-β启动子活性则是通路激活的重要指标，因此含IFN-β启动子的报告基因系统成为不可或缺的工具。目前普遍采用的报告基因系统是Promega公司的PGL3萤火虫荧光素酶系统，以此载体为骨架，插入IFN-β启动子，获得可以用于检测IFN-β启动子活性的质粒，用于瞬时转染。但是这一过程繁琐，每次实验都需要转染步骤，并且需要裂解细胞后才能对荧光素酶进行检测。

Gaussia luciferase(Gluc)是近年来发现的荧光素酶家族中最小的成员，能够催化氧化腔肠素，该酶的发射光谱宽，能够发出波长为480nm的蓝色荧光。与萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，Fluc)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，Rluc)相比，Gluc的发光强度高，检测灵敏度好，稳定性高，最重要的是Gluc可以分泌到细胞外，无需裂解细胞，便可以直接利用上清进行检测，操作简便。目前，Gluc得到广泛的应用，如哺乳动物细胞培养中的支原体污染检测、蛋白互作和定位研究、siRNA沉默技术、启动子活性监测、肿瘤模型药物的疗效评价、肿瘤发生发展情况实时监测和高通量药物筛选等。

CN104017818A公开了亚细胞定位的炎症小体活性报告系统及其应用，所述系统中包括的7种质粒主要通过将细胞器定位基因、白介素1β前体编码基因(pro-IL-1β)和分泌型荧光素酶(DN-Gluc)顺次克隆至表达载体pcDNA3.1的多克隆位点区域而得到；将系统所包含的各质粒分别转染至靶细胞中，可通过检测细胞外上清液中的荧光素酶活性，对炎症小体的活性进行定量分析，具有高效、快捷和简便等优势，应用于炎症小体相关的药物筛选、分子机制、动物活体研究及相关产品的开发。但是该系统不能用于鉴定IFN通路激活的状态。

因此，有必要构建一种新的报告基因细胞株用于检测IFN通路激活状态。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种报告基因细胞株及其构建方法和应用，所述报告基因细胞株的基因组中整合有IFN-β启动子和报告基因形成的嵌合基因，为检测IFN通路激活提供了简易手段，为进一步研究病毒诱导IFN-β的转录、调控，动态监测IFN-β启动子活性奠定了基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合基因，所述嵌合基因包括IFN-β启动子和报告基因；

所述报告基因为分泌性荧光素酶基因。