[发明专利]一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法

权利要求书

1.一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，其特征在于：包括，

称取磨粉后的油料作物，加入内标物5α-胆甾烷醇溶液，再加入氯仿与甲醇混合溶剂，超声提取2次，过滤，将滤液保留，滤渣再用正己烷进行同样的超声提取处理1次，合并提取液，并用旋蒸结合氮吹以除去其内有机溶剂，得提取目标物；其中，内标物5α-胆甾烷醇溶液配制方法为将5α-胆甾烷醇粉末用甲基叔丁基醚配制成1mg/mL溶液；氯仿与甲醇体积比例为2:1；超声提取条件为在100W超声功率下37℃恒温提取30min；

将提取目标物依次进行净化、衍生化和过滤后，注入进样瓶中待测；

其中，所述净化为将提取目标物溶于氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂中，得重新溶解后的溶液后，置于完成活化的硅胶固相萃取小柱SPE顶端，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，并用氮气除去其中的有机溶剂，得净化后产物；其中，提取物重新溶解后浓度为10mg/mL；用洗脱液进行洗脱，洗脱方法为，取1mL溶液用2mL氯仿甲醇2:1，v/v，进行洗脱；SPE柱规格为500mg/mL，SPE活化方法为，用10mL氯仿甲醇2:1，v/v，分2次淋洗小柱；

所述衍生化为取净化后所得产物置于小玻璃瓶中用衍生化试剂BSTFA-TMCS 99:1 ，v/v，进行70℃水浴1h，衍生化结束后将衍生化试剂用氮吹除去；

所述过滤为将衍生化后的产物重新溶于色谱级正己烷中，过有机滤膜，注入进样瓶中待测；

将待测样品注入GC-MS中进行分析，对总离子流色谱图TIC中各目标物的特征离子进行提取，得到目标物的提取离子色谱图EIC，对EIC中各目标物的峰面积进行积分，并按以下公式计算各目标物的浓度：

其中，F：转换系数；R_S: 5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；C_S: 5α-胆甾烷醇浓度；R_X: 目标物在EIC中的峰面积；C_X：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度；

其中，所述转换系数，其计算方法为：用氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂配置5α-胆甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品的混合溶液，进行稀释，得到稀释后的5α-胆甾烷醇浓度为3.05~780μg/mL，菜油甾醇浓度为1.04~266.42μg/mL，豆甾醇浓度为1.02~260.88μg/mL，谷甾醇浓度为1.22~312.36μg/mL，环木菠萝稀醇浓度为1.71~438.83μg/mL，24-亚甲基环木菠萝烷醇浓度为2.02~516.60μg/mL，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为0.75~95.64μg/mL，豆甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为0.57~73.52μg/mL，谷甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为1.27~162.15μg/mL，用氮气吹干溶剂，进行衍生化处理，吹干衍生化试剂后重新溶于色谱级正己烷中，待测；

按以下公式计算游离态甾醇及甾醇糖苷相对5α-胆甾烷醇转换系数的平均值：

其中，F：转换系数；R_S: 5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；C_S: 5α-胆甾烷醇浓度；R_X: 目标物在EIC中的峰面积；C_X：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度；

其中，所述目标物为游离态甾醇和甾醇糖苷，游离态甾醇为菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇和24-亚甲基环木菠萝烷醇，甾醇糖苷为菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷；

其中，菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷相对5α-胆甾烷醇的转换系数分别在8~130μg/mL、 8~130μg/mL、 8~160μg/mL、 13~220μg/mL、 15~260μg/mL、6~50μg/mL、1~65μg/mL和 5~90μg/mL范围内保持稳定，其值分别为：0.35、0.68、0.24、0.82、0.69、0.51、0.78和0.50；

GC-MS法，其中，气相色谱GC条件：采用DB-5HT，30m×0.25mm×0.1μm，毛细管柱；进样量：1μL；分流比：1：10；载气：He；流速：1.0mL/min ；进样口温度：310℃；程序升温条件：200℃保持1min，以10℃/min升至340℃，保持3min，再以2℃/min升至370℃，保持12min；质谱MS条件：EI离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；EI能量：70eV；质量数扫描范围：50-900m/z；扫描模式：全扫描；EIC提取离子色谱图下提取的定量离子质荷比：5α-胆甾烷醇：370，菜油甾醇：382，豆甾醇：394，谷甾醇：396，环木菠萝稀醇：408，24-亚甲基环木菠萝烷醇：422，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷：383，豆甾醇吡喃葡萄糖苷：395，谷甾醇吡喃葡萄糖苷：397。