[发明专利]一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法

说明书

本发明公开了一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法，属于生物技术领域。该方法包括以下步骤：(1)将靶向特定基因靶位点的sgRNA导入含有正负筛选标记(coda::nptii或hpt::coda)的基因编辑载体中；(2)以基因编辑载体为基础构建基因敲除载体并将其通过农杆菌转化需要处理的植株，实施转基因，并通过nptii或hygromycin进行正向筛选获得第一代(拟南芥叫T1代，烟草、水稻等叫T0代)含有转基因元件的基因定点突变材料；(3)种植步骤(2)中所获得的第一代突变体，并收获种子。(4)利用负向筛选标记codA，对所收获的种子进行筛选，最终获得不含转基因成分的基因定点突变材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法。

背景技术

基因组编辑技术可以在基因组中产生定点突变，是近十年来新兴的分子生物学技术，其主要依赖于序列特异性核酸酶(Sequence Specific Nucleases,SSNs)对基因组定向切割产生DNA双链断裂(DNA double-strandbreaks，DSBs)。生物体细胞主要通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)两种途径来修复DSBs。NHEJ修复途径会产生几个碱基的插入或缺失，造成移码突变，从而导致基因的敲除；HR修复途径会使基因组完整修复或在提供模板的情况下，发生碱基替换或定点插入。目前，常用的SSNs主要包括锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs)、转录激活子样效应核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered,regularly interspaced,short palindromic repeat/CRISPR，CRISPR/Cas)系统。以上三种序列特异性核酸酶都可以在基因组中产生DSBs，进而诱发基因定点突变，其中CRISPR/Cas9技术具有简单便捷高效等特点，目前在小鼠、大鼠、猪、牛、狗等多种动物及其细胞系以及包括小麦、玉米、水稻、烟草、拟南芥、番茄等在内的多种植物中已经得到了广泛应用。

常规植物基因组编辑技术主要是利用农杆菌或基因枪将SSNs，如CRISPR/Cas9，以DNA的形式转入植物细胞，并随机整合到植物基因组中，进而对基因组进行编辑。SSNs，如CRISPR/Cas9，整合到植物基因组中会产生多种不良效应。首先，在基础研究领域：SSNs，如CRISPR/Cas9的DNA表达框整合到基因组中会带来因CRISPR/Cas9持续表达导致的潜在脱靶效应增加的问题。其次，SSNs属于外源DNA，整合到植物基因组中会涉及到转基因问题，难以进行从管理部门获得商业种植批准。因此，转基因组分的剔除，是基因组编辑作物获得商业应用的必要先决条件。

目前，鉴定并获取不含有外源转基因片段基因组编辑作物的方法主要有以下几种：1)通过后代自交或回交分离，并提取基因组DNA，利用PCR并辅以Southern的方法进行鉴定。这种方法中基因组DNA提取比较繁琐，鉴定工作量大，而且PCR假阳性较高，Southern操作也极为复杂。2)在种子中加入特异性表达mcherry荧光蛋白作为转基因标记元件，进行后代分离鉴定。这种方法目前仅适用于拟南芥中，没有在植物中广泛应用，此外也需要有特定的荧光显微镜，该设备条件不是所有实验室都具备。3)将CRISPR/Cas9以核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP)的形式转化植物原生质体或者幼胚，进而获得不含外源DNA的定点突变材料。但是原生质体转化需要经历原生质体培养、愈伤诱导、分化再生等多种复杂问题，在单子叶植物中难以实现。幼胚转化的方法目前只在小麦和玉米中得以实现。此外，这两种方法均不用抗生素筛选，后续鉴定耗费极大的人力物力。4)将CRISPR/Cas9元件与靶向除草剂抗性P450酶的RNAi元件偶联，也可通过除草剂筛选，鉴定无转基因编辑的水稻。但是这种方法需要对后代进行长期种植和筛选，增加了人力投入。因此，本领域仍亟需一种通用的鉴定非转基因后代定点突变体的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法。